西南大学 兽医生物制品学.doc

猪传染性胃肠炎疫苗研究进展常浩(西南大学荣昌校区动物医学系 重庆荣昌420460)摘 要：猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，不同年龄和品种的猪均可感染，严重危害着全世界养猪业的健康发展。疫苗接种是防控本病的关键措施之一。常规疫苗在防控猪传染性胃肠炎中发挥了巨大的作用，但在某种程度上存在不可避免的缺陷，对根除和消灭传染病带来了严重困难。随着分子生物学技术的不断发展，基因工程疫苗的研究也不断深入，给本病的防控带来了新的思路。论文对猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展进行了综述，特别是对亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗等基因工程疫苗的研究进行了比较深入的概括。关键词：猪传染性胃肠炎；疫苗；基因工程猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是猪的一种高度接触性肠道疾病，以呕吐、严重腹泻和失水为特征。各种年龄猪都可发病，2周龄以内仔猪病死率很高，可达100%；5周龄以上猪的病死率很低，成年猪几乎没有死亡。该病1946年由Doyle和Hutchings在美国首次报道，以后世界上许多国家和地区(日本、英国、法国、荷兰、德国、意大利、前苏联、中国台湾省等)都相继报道。从20世纪6O年代末期，我国就有了关于本病的报道，近年来疫区更为扩大，并与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻混合感染，给养猪业造成了严重的经济损失。1 病原特征11 病毒结构引起TGE的病原猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastro enteritis virus，TGEV)属冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子直径为90nm200nm，呈圆形、椭圆形或多边形，表面有囊膜，囊膜上覆有花瓣状纤突，纤突长约18 nm24 nm，以极小的柄连于囊膜表面，其末端呈球形，直径约10 nm，电镜制片时容易使纤突脱落，所以常常只看到囊膜的边界，或者只在囊膜的某些部位有这种花瓣状的纤突，并可见到一个电子透明的中心或没有特征的核心。病毒粒子内部为RNA和核衣壳蛋白组成的核蛋白核心，呈螺旋结构。12 病毒基因组结构TGEV基因组为不分段的单股正链RNA，其5端有帽子结构,3端有poly(A)尾，基因组与核蛋白相结合，具有感染性。整个基因组全长约为2.85l0 bp，分子质量为610ku，分为7个区，每个区有一个或两个开放阅读框(ORFs)，亚基因组mRNAs之间有保守序列将其分开，基因组结构为5-ORFlaORFlbS (ORF2 )一ORF3aORF3bsM(ORF4)一M (ORF5)一N (ORF6)一ORF7-3 。ORF2、ORF4、ORF5和ORF6分别编码病毒的纤突(S)蛋白、小膜(sM)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白1。ORFla和ORFlb 编码病毒的聚合酶。0RFla上游有一个3个密码子长的ORF(upstreamORF，uORF)，对ORF1a和ORF1b转译起调控作用，最大的非编码区为位于3 端ORF7基因下游不含poly(A)的280个核苷酸。研究表明，TGEV 基因组具有很高的重组率，这一现象类似于分节段的RNA病毒【2-3】2 疫苗研究TGE以呕吐、水样腹泻、脱水为特征。发病急，传播快，各种年龄的猪都可以感染，仔猪病死率高，病死率可达100 ，是引起仔猪死亡的重要原因。日龄较大的或成年猪虽然发病但几乎没有死亡，然而可引起掉膘、降低饲料报酬、增加药费和人力等开支，造成的损失非常严重。对于该病的防控，国内外兽医工作者进行了大量的工作，但至今仍未找到安全有效的方法和治疗的理想药物。现已证实，TGEV的免疫属于获自母猪乳汁的被动免疫4。长期以来，疫苗研究的目标在于使起主要免疫作用的IgA抗体能不断分泌，但效果总不能令人满意。21 强毒疫苗一般某个猪场第一次暴发TGE时，初生仔猪几乎100% 死亡。最初人们采用发病猪的肠内容物和粪便感染全场成年猪，尤其是妊娠母猪，使之产生免疫力，通过初乳保护仔猪。但这种方法使该猪场的场地受到严重污染，导致强毒持续存在，腹泻发病率虽然降低，但常年会发生，此法现已经被禁止。22 灭活疫苗灭活苗可以解决场地污染问题，但其诱导的免疫应答产生较慢，且不能激发产生以SIgA 抗体为主的黏膜免疫反应，制苗成本也比较昂贵。采取急性发病并具有典型症状的病猪空肠(包括肠内容物)及肠系膜淋巴结制成组织灭活苗，实验室和野外试验均表明，安全性可靠，保护率较高，可有效控制TGE的暴发和持续蔓延。哈尔滨兽医研究所2004年在暴发TGE猪场分离到TB株，该病毒株已适应细胞培养且能致细胞病变。用该病毒制成灭活细胞苗，在流行TGE的猪场进行试验，结果免疫母猪所产仔猪在断乳时的死亡率平均是85% ，而1986年一1996年间，在美国、加拿大、荷兰、英国、法国和澳大利亚等国哺乳期仔猪病死率为l15 9%186% 。23 弱毒疫苗弱毒疫苗能刺激黏膜免疫，肌肉注射产生抗体快、水平高，欧美现在使用的疫苗主要是弱毒疫苗。弱毒疫苗对预防该病的发生起到了重要的作用，但同样存在其他弱毒疫苗所存在的易返祖、有潜在感染危险等缺陷。TGEV 弱毒疫苗株主要有美国的TGEVac株、匈牙利的CKP株和日本的TO一163株等5。童有恩等用TEG华毒克隆弱毒株和适应Vero细胞系后转仔猪肾原代细胞培养的PEDCV777克隆弱毒株以1：1配比制成TGE、PED二联弱毒疫苗，主动免疫和被动免疫的保护率分别为977% 和98 %。Aynaud等将TGEV突变株188一SG致弱后分别口服、肌肉注射、眼结膜途径免疫妊娠母猪，使哺乳仔猪得到了保护。但必须经过多次免疫才能达到良好的免疫效果。24 基因工程疫苗随着分子生物学技术的飞速发展，基因工程疫苗以成本低、生产简单、存储方便等优势受到越来越多人的瞩目，各种TGEV基因工程疫苗的研究也得到了突飞猛进的发展。完整的TGEV包含4种结构蛋白，纤突(spike或S)蛋白、小膜(sM)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)，其中s蛋白形成典型的花瓣状囊膜突起，突出于病毒粒子表面，它携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白6，而且含有宿主细胞氨肽酶受体的识别位点，决定着宿主细胞亲嗜性、TGEV 的致病性和血凝作用，还具有细胞膜融合作用，可以使病毒核蛋白进人细胞浆，是目前TGE基因工程疫苗的研究靶点7。241 亚单位疫苗主要为生物合成亚单位疫苗,又称重组亚单位(recombinant subunitvaccines)，是利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导人受体菌(如大肠埃希菌)或细胞，使其在受体中表达保护性抗原肽段，然后提取保护性抗原肽段制成的疫苗。用杆状病毒为载体在昆虫细胞系表达S基因，提取蛋白制成亚单位疫苗对妊娠母猪进行加强免疫，可显著提高母猪血清和初乳中的抗体水平8。用鼠乳腺细胞EMT6培养上清中收获的重组S蛋白免疫Balbc小鼠，其血清中的抗体可达到886 ngmL019 ngmL，此研究为使用乳腺生物反应器生产可食疫苗奠定了基础。242 核酸疫苗 核酸疫苗(nucleic acid vaccine)又称基因疫苗(gene vaccine)或DNA 疫苗(DNAvaccine)，包括DNA疫苗和RNA疫苗，是指把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA 直接注射到动物体内，使外源基因通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。1996年，世界卫生组织在日内瓦召开国际会议，将其统一命名为核酸疫苗(nucleic acid vaccine)9。核酸疫苗具有易于制备、可塑性大、生产工艺简单和成本低等优点，并能使疫苗抗原在靶细胞内以天然的方式合成加工后递呈给免疫系统，因此被誉为第三次疫苗的革命。243 重组活载体疫苗 重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体(或称外源基因携带者)，把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗免疫动物向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近，可诱导产生体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，所以可以避免亚单位疫苗的很多缺点。如果在载体中同时插入多个外源基因，就可以达到免疫一种疫苗，防治多种疾病的目的，是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一10。244 转基因植物疫苗转基因植物疫苗指用转基因方法，将编码有效免疫原的基因导入可食用植物细胞的基因组中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定的表达和积累，把转基因植物组织饲喂给动物，转基因植物表达的抗原即可诱导动物产生相应的免疫应答。在过去的十几年中，许多的研究工作已经证实植物疫苗是切实可行的。由于植物疫苗具有生产、贮运简单、无污染、元副作用、易于规模化生产、能对蛋白进行准确加工修饰，使蛋白的三维空间更趋于自然状态等优点11，利用植物来表达抗原生产疫苗越来越引起大家的兴趣。3 展望TGEV分子生物学研究的发展和应用，不仅促进了其核酸、结构蛋白等方面研究的深入，也促进其新型基因工程疫苗的发展。尽管TGEV各结构基因特别是S基因在多种载体中得到了有效表达，但目前还没有高效的基因工程疫苗投入到生产当中，基因工程疫苗的研发仍是TGEV研究的重点，特别是减毒活疫苗的研发12，因为其优越性是无可争议的。另一方面，由于TGE的免疫以局部黏膜免疫为主，被动免疫特别是分泌型IgA在本病的预防中也发挥着重要作用，而且已经有利用抗体及其衍生物来防控TGE 的报道13-14。RNA 干扰技术也被用于TGEV防控的研究中15，而且效果较好。随着科学技术的不断发展，相信在不久的将来，人类就会攻克甚至彻底消灭猪传染性胃肠炎。参考文献：1 Penzes Z，Gonzalez J M，Izeta Z，at a1Complete gene sequence of transmissible gastroenteritis coronavirus PUR462一MAD clone andevolution of the Purdue virus clusterJvirusGene，2001，23(1)：1051182 Sara A，Ander I，Isabe S，ct a1Transcription regulatory sequences and expression levels in the coronavirus transmissible gastroenteritis virusJJ Virol，2002，76(3)：129313083 李建强，柳纪省，胡永浩猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究进展J动物医学进展，2006，27(2)：1-44 Peng S Y，Lv N，Zhang Y，at a1Immune response induced byspike protein from transmissible gastroenteritis coronavirus expressed in mouse mammary cellJVirus Res，2007，128(12)：52575 M6chin M c，Der Vartanian M，Der Vartanian M CThe majorsubunit ClpG of Escherichia coli CS31A fibrillae as an expression vector for different combinations of two TGEV coronavirus epitopesJGene，1996，179(2)：2112186 李月涛，霍金龙，信吉阁，等核酸疫苗的研究及应用进展rJ生物技术通报，2006，4：167 韩国全猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株M 基因序列分析、原核表达研究及真核表达载体构建D四川雅安：四川农业大学，20068 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