多功能Au-Fe3O4纳米颗粒对癌细胞的多模式和超灵敏检测.doc

多功能 Au-Fe3O4 纳米颗粒对癌细胞的多模式和超灵敏检测#1 2 1 1 11*51015（1. 兰州大学应用有机化学国家重点实验室,兰州 730000；2. 兰州大学第一临床医学院，兰州 730000）摘要：癌症早期诊断和治疗至关重要，与传统单模式纳米材料相比，多功能纳米复合材料能为癌症早期诊断和治疗提供更精确的多方位信息。基于 Au-Fe3O4 纳米颗粒的新奇结构，本工作报道了一种偶联叶酸和铕配合物的 Au-Fe3O4 多功能纳米探针。该纳米探针能应用于叶酸受体过度表达癌细胞（如，HeLa 细胞）的比色/荧光双模式检测和量化癌细胞。该纳米探针对癌细胞的检测限达 100 个，在生物医学研究中能为癌症早期诊断提供更准确的信息。关键词：癌症早期诊断；Au-Fe3O4 纳米颗粒；叶酸；铕配合物；纳米探针；比色/荧光双模式检测中图分类号：O6 14.8A multifunctional AuFe3O4 nanoparticles for multimodaland ultrasensitive detection of cancer cellsLIU Jian1, ZHANG Wei2, YANG Zhengyin1, LI Tianrong1, HUO Xing1, WANGBaodui120(1. StateKey Laboratory ofAppliedOrganic Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou,730000;2. The First Clinical Medical School, Lanzhou University, Lanzhou, 730000)Abstract: It is essential for early diagnosis and treatment of cancer cell. Compared withtraditional single-modal nanoparticles, multifunctional nanoparticles can offer more precise andmultiparametric information for the early diagnosis of cancer and better patient management.253035Based on the novel structure of Au-Fe3O4 nanoparticles (NPs), we report folic acid (FA) andEu(III) complex-conjugated Au-Fe3O4 NPs for the simultaneous multimodal detection andcounting of cancer cells based on colorimetric/fluorigenic dual-modal detection of cancer cellswith excessive expression folate receptor.The detection limit of this nanoprobe (1e) reaches 100cells, thus providing comprehensive and reliable information for more accurate and advancedearly diagnosis of cancers in biomedical research.Key words: early diagnosis of cancer cell; Au-Fe3O4NPs; folic acid; Eu(III) complex; nanoprobe;colorimetric/fluorigenic dual-modal0 引言癌症早期诊断和治疗至关重要，多功能纳米复合材料作为一种新型检测手段，在快速识别、高度敏感诊断和准确分析血液或其他体液中的癌细胞得到了巨大的发展。与传统单模式纳米材料相比,多功能纳米粒子可以选择性靶向标记癌细胞，随后运用各种检测技术对其检测或造影1-3光学响应的多功能纳米粒子可以对有限的癌细胞提供定量信息，从而准确地量化癌细胞在癌40症早期表达水平。最近研究表明，组成结构新颖的 Au-Fe3O4 纳米颗粒(Nps) 具有特殊的磁性和光学性质，能用于检测肿瘤细胞4 5基金项目：国家自然科学基金资助项目(21271093, 81171337, 21001040, 21202068)；国家重点基础研究发展计划(973 计划)资助项目(2012CB933102)；甘肃省自然基金资助项目(1107RJZA255)；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20100211120010)作者简介：刘健(1986-)，男，硕士研究生，主要研究方向：生物无机化学-1-刘健 ，张伟 ，杨正银 ，李天荣 ，火星 ，汪宝堆，从而为癌症早期诊断和治疗提供更精确的多方位信息。此外,具有催化活性和。此外，Fe3O4 纳米颗粒具有过氧化酶活性 ，能够催化氧化某些敏感底物 (染料) 而进行比色法定量检测癌细胞。研究发现，发冷光的镧系金属元素负载在磁645大 Stokes 位移、窄发射峰宽等性质，能够减弱细胞等生物样本的背景信号而放大检测信号从而使得检测限达单分子水平7-9基于这些发现，我们设计把叶酸(FA)、铕(Eu)配合物负载在 Au-Fe3O4 纳米颗粒(Nps)上，得到一种新型的纳米探针。该探针具有叶酸对癌细胞的靶向识别功能，而 Au-Fe3O4 纳米颗粒催化 H2O2 氧化 3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)的比色检测和钙-吡啶二羧酸 (CaDPA)敏5055化 Eu 配合物的的荧光检测。实验结果证明，这种多功能纳米探针可以在生理溶液里超灵敏检测 CaDPA，实现对 H2O2 氧化 TMB 的优良催化活性。进一步实验发现，该纳米探针能够比色/荧光双模式检测和量化癌细胞，对癌细胞的检测限达 100 个。1 实验1.1 试剂与仪器试剂：HAuCl4 3H2O、三丁基溴化铵(TBAB) 、油胺、油酸、1,2,3,4-四氢化萘、1-十八烯、Fe(CO)5、聚乙二醇二胺(MW=3400)、聚乙二醇(MW=4000)和 3,4-二羟基苯甲醛购自SigmaAldrich 公司。叶酸、硫代乙醇酸、二环己基碳二亚胺(DCC)、(NHS)、3,35,5-四甲基联苯胺(TMB)购自阿拉丁试剂公司。除了 DMF、DMSO、CHCl3 除水外，其他实际试剂未经二次处理直接使用。1，-PEG 二胺（NH2-PEG-NH2），3,4-二羟基苯甲醛-PEG-胺(DIB-PEG-NH2)60和二乙三胺五乙酸酐(DTPAA)10-12均参照文献方法合成。17400 振动样品磁强计，HitachiRF-4500荧光光谱仪，TTherrnoMattson型傅里叶变换红外光谱仪，Lambda 950紫外吸收光谱仪。1.2 纳米探针（1e）的合成过程651e 的合成方法如图 1 所示。图 1 1e 的合成方法Fig. 1 Synthetic method of 1e-2-性纳米颗粒可以很好地用于细胞的荧光成像和磁共振成像 。Eu(III)配合物有长荧光寿命、。仪器：Varian 400 MHz H NMR核磁共振仪，Philips EM 420 (120kV)型透射电镜，LakeShore1.2.1Au-Fe3O4 纳米颗粒的合成7013, 0.1 g HAuCl4 3H2O 溶于油胺(10 mL)和四氢化萘(10 mL)中形成的黄色溶液，TBAB (1 mmol)溶于油胺(1 mL)和四氢化萘(1 mL)，快速加入上述溶液中，黄色溶液迅速变紫红色，室温搅拌 1h。加乙醇 40 mL，离心，N2 氛围下干燥。Au NP (20 mg) 溶于油胺 (2 mL) ，油酸(1 mL)和 1-十八烯(20 mL)混合溶液中，N2 氛围下 120 脱水 1 h，0.10 mL Fe(CO) 5 快速注入，然后快速升温，维持在 300 回流 25min。75黑褐色反应产物冷却到室温，加异丙醇 40 mL，离心，少量乙醇清洗 3 次，产物最终分散到正己烷中保存。1.2.2HS-PEG-NH2 (1a) 的合成0.092 g 硫代乙醇酸(1 mmol) 溶于 20 mL DMF, 加入 0.40 g DCC (1.5 mmol) 和 0.14g NHS(1.2 mmol)，室温暗处搅拌 14h。白色副产物离心除去，离心液中加入 3.4g 聚乙二醇80二胺（MW=3400），在室温下继续搅拌 14h。减压蒸馏除去溶剂，加少量 CHCl3 溶解残渣，离1SH2CH2), 3.84 (t, 2H, NH2CH2CH2), 3.70 (bs, 187H, PEG3400), 3.41 (t, 2H, NH2CH2).1.2.3 HS-PEH-NH-FA (1b) 的合成叶酸(0.044 g,0.1 mmol)溶解在 3 mLDMSO 中，加入 0.04 g DCC (0.15mmol) 和 0.0148590g NHS(0.012 mmol)，室温暗处搅拌 14h。白色副产物离心除去，离心液中加入 0.23 g(0.11mmol) 1a，在室温下继续搅拌 14h。减压蒸馏除去溶剂，加少量 CHCl3 溶解残渣，离心，1s, C8), 7.61 (2H, d, C13 和 C15), 6.61 (2H, d, C12 和 C16), 4.47 (2H, s, C9), 4.33(2H, dd, C19), 3.80 (s, 2H, SH2CH2), 3.64 (t, 2H, NH2CH2CH2), 3.50 (bs, 187H, PEG3400),2.81 (t, 2H, NH2CH2), 2.65 (2H, m, C25), 2.55 (2H, m, C26), 2.20(2H, m, C20), 1.80ppm (2H, m, C19).1.2.4 Eu:DTPA-NH2-PEG-DIB-Fe3O4-Au (1d)的合成35.7 mg (0.1mmol) DTPAA 溶于DMF(5 mL), 1c (400 mg, 0.1 mmol)溶于CHCl3，10min内缓慢滴入溶液中，室温搅拌12h。加乙醚沉淀离心。用CHCl3 , DMF 、乙醚 (1/1/5, v/v/v)95洗3次, 真空干燥，产物保存在-20。DIB-PEG-DTPA (200 mg) 溶于 CHCl3(10 mL), 加入Au-Fe3O4 (30 mg)，分散体系在室温下搅拌过夜。加入正己烷，离心。产物用CHCl3 和正己烷（1/5, v/v）清洗3遍，最后分散在20 mL CHCl3中。5 mL 乙醇的EuCl3.6H2O (9 mg) 溶液加入上述溶液中，室温下搅拌12h。加入正己烷沉淀出纳米颗粒，离心分离，CHCl3、乙醇、正己烷(1/1/5, v/v/v) 洗3次, 真空干燥，产物分散在CHCl3。1001051.2.5 Eu:DTPA-PEG-Fe3O4-Au-HS-PEG-FA (1e) 的合成5 mL 1b（0.04 g）的CHCl3溶液中加入0.02g 1d，分散液在室温暗处搅拌反应2h。正己烷沉淀，离心，CHCl3、正己烷(1/5, v/v) 洗3次,产物分散在二次水中，室温下水透析24h。收集产物水溶液，避光5密封保存。1.3 过氧化氢酶活性的测定5HAc-NaAc 缓冲液中 (0.2 M) 依次加入 20L 目标纳米探针(12.4-3-mM)，50 L H2O2（C=20Au-Fe3O4 纳米颗粒的合成参照文献方法心，离心液用乙醚沉淀，干燥产物保存在-20。 HNMR (CDCl3, 400 MHz): = 4.2 (s, 2H,离心液用乙醚沉淀出，真空干燥，产物保存在-20。 HNMR (CDCl3, 400 MHz): =8.62 (1H,由参考文献 ，首先选定 Fe3O4 纳米颗粒最佳 pH 为 4.0，H2O2 浓度 20 mM。在 2.0 mLmM）和 30 L TMB (15.0 mM)作为催化底物，在不同温度（060）中各孵育一定时间（10min，20 min）并测定紫外吸收强度，选择出最佳温度。在最佳温度条件下，只改变 pH（2.59.0），其他条件不变，验证得到最佳 pH。在最佳温度、pH 和缓冲体系，选择出 H2O2110最佳浓度。为了进一步验证其过氧化氢酶活性，我们又选用二苯胺（DAB）为底物，在相同条件下检测其颜色变化。为了比较该纳米探针各金属组分的过氧化氢酶活性，我们把修饰成水溶性的 Au 纳米颗粒、Fe3O4 纳米颗粒、Au 纳米颗粒+ Fe3O4 纳米颗粒、Au-Fe3O4 纳米颗粒作为相互对照组（Au NPs5nm，Fe3O4 NPs 12nm），其中 Fe 浓度为 12.4 mM，Au 浓度为 7.0 mM。相对应固定浓度的纳115米颗粒在 2.0 mLHAc-NaAc 缓冲液中 (0.2 M ，pH = 4.5) 和 0.3 mM TMB 、不同浓度 H2O2（0.5 mL，020 mM）在室温下反应，在 653nm 测定其随时间变化的紫外吸收强度。1.4 细胞毒性测定作为一种癌细胞探针，首先 1e 自身应该不对细胞有很强烈的毒性。我们选用 HeLa 细胞系进行甲基噻唑基四唑实验（MTT 法），细胞固定在 10% 胚胎牛血清培养基的 96 孔板中（5104120125个/孔），在 37 ，5% CO2 氛围下培养 24h。加入不同浓度的 1e (1, 5, 50, 100 g/mL ，培养基中)，相同条件下培养 24h，48h ，72h。然后依次加入 MTT (20 mL/孔, 5 mg/mL) 培养 4h，DMSO（100 L/孔）培养条件下稳定 15min，用酶标仪选定 492 nm 观测孔板的光强度。1.5 比色/荧光法检测和量化癌细胞为了检测 1e 对癌细胞的特异检测性，我们选用具有叶酸受体的 HeLa 细胞系（人宫颈癌1415。选用 HeLa 细胞系作为实验组，NIH-3T3 作为对照组。首先，我们把定量的两种细胞系（6000 个）分别和一系列浓度梯度的 1e (16、32、64 mM) 在 96 孔板里孵育 2h 后立即用PBS 缓冲液洗 3 遍除去未靶向细胞的游离态 1e。与 1e 作用后的细胞分散在 0.6 ml PBS 缓冲130135140145液中，加入 TMB (0.3 mM)混匀后孵育 15min，直接在 653 nm 用酶标仪检测。2 3 4 5 56 6 7遍除去未靶向细胞的游离态 1e。与 1e 作用后的细胞分散在 0.6 ml PBS 缓冲液中，加入 TMB(0.3 mM)混匀后孵 15min，直接在 653nm 用酶标仪检测。类似的，我们选用 HeLa 细胞系作为实验组，NIH-3T3 作为对照组。我们把定量的两种细胞系（6000 个）分别和一系列浓度梯度的 1e (16、32、64 mM)在 Eppendorf 管里孵育 2h后立即离心（1000 rpm，30s）除去未靶向细胞的游离态 1e，并用 PBS 缓冲液洗 3 遍。与 1e作用后的细胞分散在 2 mL PBS 缓冲液中，加入 CaDPA (0.04 mM)混匀后孵育 30 min，直接用于荧光检测。2 3 4 5 56 6 730s）除去未靶向细胞的游离态 1e，并用 PBS 缓冲液洗 3 遍。与 1e 作用后的细胞分散在 2 mLPBS 缓冲液中，加入 CaDPA (0.04 mM)混匀后孵育 30 min，直接用于荧光检测。2 结果与讨论1e 的合成方法如图 1 所示，在 DCC、NHS 活化作用下，聚乙二醇二胺一端巯基化，一端-4-细胞）作为实验组和没有叶酸受体的 NIH-3T3 细胞系（小鼠成纤维细胞）作为对照组随后实验中，不同梯度个数的 HeLa 细胞（0、110 、110 、110 、110 、510 、110 、510 、110 ）和定量 1e（32 mM）在 96 孔板孵育 2h 后立即用 PBS 缓冲液洗 3在另一组实验中，不同梯度个数的 HeLa 细胞（0、110 、110 、110 、110 、510 、110 、510 、110 ）和定量 1e（32 mM）在 Eppendorf 管里孵育 2h 后立即离心（1000rpm，连接叶酸，得到 1b。聚乙二醇-3，4-二羟基苯甲醛（1c）的活泼胺基和 DTPAA 反应，通过配位原理，邻苯二酚基团取代 Au-Fe3O4 NPs 表面油酸/油胺，DTPA 多羧和 Eu（III）配位，得到 1d。最后能够和 Au NPs 强烈配位的巯基把 1b 偶联在纳米颗粒上，得到目标纳米探针1e。由热分解法制备的 Au-Fe3O4 NPs 水溶性极差，但功能化修饰得到的目标纳米探针 1e 水150155溶性良好；修饰前后，纳米颗粒形态学变化可以忽略，但水动力学半径显著增加(图 2)。图 2 Au-Fe3O4 Nps 修饰前后形貌变化测定：修饰前分散在正己烷中（A），修饰后分散在水中（B）的电镜照片；修饰前后纳米颗粒的水动力学直径变化Fig. 2 Morphology changes before and after modification of Au-Fe3O4 Nps. TEM images of Au-Fe3O4Nps dispersed in hexane before (A) and after (B) modification；Hydrodynamic diameters measuredby DLS for the as-synthesized NPs dispersed in hexane and 1e in PBS1e 的结构用红外和荧光光谱进行了进一步的证实，偶联在 Fe3O4 一端的 DTPA 配位 Eu（III）通过红外和荧光得到验证。油相法制备的 Au- Fe3O4 Nps 在 2850 cm-1和 2915 cm-1160165170强吸收归属于油酸/油胺 C-H 对称和不对称的伸缩振动。Fe3O4 一端修饰完后，新出现的 1625-1 -1振动。图 3 IR 图谱: Au-Fe3O4 NPs; (B) Au-Fe3O4-PEG-DTPA; (C) 1d; (D) FA-PEG-SH-Au-Fe3O4.Fig. 3 The IR spectra of (A) as-synthesized Au-Fe3O4 NPs; (B) Au-Fe3O4-PEG-DTPA; (C) 1d;(D)FA-PEG-SH-Au-Fe3O4.2.1 过氧化氢酶活性的测定紫外吸收光谱测定，1e 的过氧化氢酶催化活性在本体系中最佳条件是:T=35 ,HAc-NaAc 缓冲体系 pH=4.0，C(H2O2)=2.0 mM。同时为了进一步验证其过氧化氢酶活性，我们又选用二苯胺（DAB）为底物，在相同条件下检测其颜色变化。如图 4(A)所示，两种底物都能被很快转变为蓝色和棕色氧化态。为了比较该纳米探针各金属组分的过氧化氢酶活性，我们把修饰成水溶性的 Au 纳米颗粒、Fe3O4纳米颗粒、Au 纳米颗粒+ Fe3O4纳米颗粒、Au-Fe3O4 纳米颗粒作为相互对照组。如图 4(B)所示，两种底物都能被该探-5-cm 峰归属于 C=O 伸缩振动；Au 一端偶联叶酸后，新出现的 1694 cm 峰归属于 CO-NH 伸缩针迅速催化氧化变色。紫外光谱显示，不同纳米颗粒对 TMB 都有催化氧化活性，但催175180185190化能力为 1e Au + Fe3O4 Fe3O4 Au。我们推测，1e（哑铃状 Au-Fe3O4 纳米颗粒）的催化活性高于相应量的 Au 纳米颗粒和 Fe3O4 纳米颗粒的混合体系的原因是，分别具有催化活性的 Au 纳米颗粒和 Fe3O4 纳米颗粒在哑铃状 Au- Fe3O4 纳米颗粒中表现出协同作用。图 4 1e 的过氧化氢酶活性的测定:（A）1e 对 TMB 和 DAB 催化颜色变化；（B）Au (a), Fe3O4 NPs (b), Au+ Fe3O4 NPs (c), AuFe3O4 NPs (d)四个实验组在 PBS 缓冲液 (pH = 4.5) ，5.0 mM H2O2 和 0.3 mM TMB体系中孵育 15 min 后的的紫外光谱图（照片显示各实验组颜色变化）Fig. 4 The determination of catalase activity of 1e. (A) Photographs show the production ofcoloured product upon addition of 1e to TMB and DAB at pH 4.0; (B) UV-vis spectra of PBS solutions(pH = 4.5) containing 5.0 mM H2O2 and 0.3 mM TMB in the presence of an equal number of Au (a),Fe3O4 NPs (b), Au + Fe3O4 NPs (c), and AuFe3O4 NPs (d) for 15 min. Inset: photographs of differentsolutions corresponding to (ad).2.2 细胞毒性测定在体外癌细胞检测应用之前，我们选用 HeLa 细胞系进行 MTT 法实验。如图 5 所示，不同浓度 1e（以纳米颗粒中金属含量为标准）和 HeLa 细胞孵育 24h，细胞存活率达到 90%以上；甚至孵育 72h 后，细胞存活率也在 70%。这表明该纳米探针毒性小，不影响细胞的存活。图5MTT法检测1e对HeLa细胞毒性Fig. 5 Detection the cytotoxicity of 1e to HeLa cell with MTT assay1952002.3 比色/荧光法检测和量化癌细胞基于 DPA 能敏化 1e 而发荧光的事实，我们尝试利用该体系通过荧光光谱来特异性量化癌细胞。如图 6（A）所示，在 613nm 处，随着 1e 浓度的上升， HeLa 细胞荧光显著强，而NIH-3T3 细胞荧光弱且增强幅度极小，而且具有大量叶酸受体的 HeLa 细胞和对应数目的NIH-3T3 细胞相比荧光强度更高。这说明了靶向 HeLa 细胞的 1e 数量逐渐增加，而 NIH-3T3细胞即使数目 1e 增加数量增加较少。在另一组实验中，如图 6(B)所示，在 613 nm 处，随着 HeLa 细胞个数的增加，荧光逐渐增强。HeLa 细胞个数增加，细胞表面靶向吸附的 1e 数量增加，通过细胞的富集作用，荧光强度逐渐增加。利用这种方法，我们对 HeLa 细胞个数的检测限达 100 个。-6-类似的，为了进一步评定 1e 的过氧化氢酶活性能否通过比色法对有叶酸受体过度表达205210的细胞定量检测，同样我们选用 HeLa 细胞系作为实验组和 NIH-3T3 作为对照组。如图 6(C)所示，随着 1e 浓度的上升，HeLa 细胞荧光显著强，而 NIH-3T3 细胞荧光弱且增强幅度可以忽略；而且具有大量叶酸受体的 HeLa 细胞和对应数目的 NIH-3T3 细胞相比紫外吸收强度更高。这些结果和荧光光谱检测结果一致。随后实验结果如图 6（D）所示，在 TMB 和 H2O2 存在下，吸附更多 1e 的癌细胞能够更快地催化体系颜色变化，可以通过肉眼轻易分辨而且在653nm 处通过紫外吸收定量检测。随着 HeLa 细胞个数增加，紫外吸收强度增加，表明更多数量 1e 被特异性靶向富集到细胞表面。利用这种方法，我们对 HeLa 细胞个数的检测限达100 个，该检测结果和荧光光谱检测结果一致。215图6比色/荧光法检测和量化癌细胞：1e孵育400s后以CaDPA 为敏化剂在613nm处的荧光强度(A) 1e浓度梯度变化，(B) HeLa细胞数目梯度变化；1e孵育400s后以TMB为比色底物在652nm处的紫外吸收强度(C) 1e浓度梯度变化，(D) HeLa细胞数目梯度变化。Fig. 6 Colorimetric/fluorigenic dual-modal detection of cancer cells. (A) The emissionintensity values at 613 nm after 400 s depend on the concentration of 1e with CaDPA as the220225230235fluorescent response reagent. (B) The emission intensity values at 613 nm after 400 s depend onthe number of HeLa cells.(C) The absorption values at 652 nm after 400 s depend on the oncentrationof 1e with TMB as the substrate. (D) The absorption values at 652 nm after 400 s depend on thenumber of HeLa cells.3 结论综上所述，我们成功地把叶酸、铕配合物偶联到 AuFe3O4 表面，得到一种新颖的纳米探针。该探针能够荧光/比色双模式检测叶酸过度表达的癌细胞，对癌细胞的检测限达 100个，这种多功能纳米探针在生物医学研究中能为癌症早期诊断提供更准确的信息。参考文献 (References)1 Lee N, Cho H R, Oh M H, et al. Multifunctional Fe3O4/TaOx Core/Shell Nanoparticles for SimultaneousMagnetic Resonance Imaging and X-ray Computed Tomography J. J. Am.Chem. Soc, 2012, 134(25):10309-10312.2 Joshi B P, Wang T D. Exogenous Molecular Probes for Targeted Imaging in Cancer: Focus on Multi-modalImaging J. Cancers, 2010, 2(2): 1251-1287.3 Sheng Z H, Hu D H, et al. 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