高致病禽流感的流行及其预防控制.doc

高致病性禽流感流行动态及预防控制禽流感(Avian influenza，AI)为禽流行性感冒也称禽流感综合征的简称。每一次暴发都给养禽业带来巨大的损失，是一种毁灭性疾病。由一种叫做A 型禽流行性感冒病毒( Avian influenza virus，AIV)引起的急性、全身性、出血性、败血性、高度致死性、烈性传染病。它的临床症状有多种类型: 有的为无明显症状的隐性感染; 有的为病死率较低的呼吸道感染; 有的为病死率较高的急性出血性感染。禽流感这些临床症状的差异, 主要是由禽流感病毒的毒型所决定的。由高致病毒株感染的禽流感称作高致病性禽流感, 它的潜伏期短, 一般数小时到23d, 来势凶猛, 死亡率极高, 有时达100%刘汉鹏高致病性禽流感防治J,现代农业科技,2006,（1）：86-87.。该病已被列人国际生物武器公约动物类传染病名单。AIV依据其外膜血凝素(Hemagglutinin ,H)和神经氨酸酶(Neuraminidase , N)抗原性的不同，目前至少可分为15个H亚型( H1H15)和9个N亚型( N1N9)。由H5和H7亚型毒株(以H5N1和H7N7为代表)所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)，其发病率和病死率都很高，危害极大Monto A S. The threat of an avian influenza pandemic J. N Engl J Med, 2005; 352:323-325.,Zeitlin G A, Maslow M J. Avian influenzaJ.Curr Infect Dis Rep,2005;7:193-199。自1997年报道禽类H5NI亚型流感病毒感染人类以来，相继有H9N2,H7N7亚型感染人类和H5N1再次感染人类的报道，引起了世人的广泛关注1, AIV威胁着人类和动物的健康。1禽流感的流行病学 禽流感最早报道于意大利(1878年)，当时称为鸡瘟( Fowl Plague )。随后，在多个欧洲国家、南美、东南亚、美国和苏联的部分地区发生，现已遍布世界各地。20世纪50年代至90年代，全球共暴发19次高致病性禽流感。进人21世纪以来，仅6年时间，全球再次暴发多起高致病性禽流感（见表1)金宁一.高致病性禽流感的流行及其预防控制J.中国免疫学杂志，2006,22(1)：5-12.。高致病性禽流感常以突然发病、高死亡率为特征，给养禽业带来毁灭性灾难，同时也威胁着人类的健康。表1 21世纪世界高致病性禽流感流行情况表Tab.l Table of Pandemic Status of Highly Pathogenic Avian Influenza in 21thCountry of AreaSubtypeAianYearHong Kong of ChinaH5NI1chicken2001ChileH7N3chicken2001Hong Kong of ChinaH5Nlchicken2002Hong Kong of ChinaH5N1chicken2003HollandH7N7chicken，turkey2003BelgiumH7N7chicken2003GermanyH7N7chicken2003Republic of KoreaH5N1chicken2003Taiwan of ChinaH5Nlduck2003AmericanH7N2chicken2004CanadaH7N2chicken2004Korea RepH5N1，H5N2chicken，duck2004JapanH5N1chicken2004VietnamH5N1chicken2004ThailandH5Nlchicken, duck, quail2004IndonesiaH5Nlchicken2004CambodiaH7N7chicken2004MalaysiaH5N1chicken, quail2004LaosH5N1chicken2004ChinaH5N1chicken, duck, goose2004Taiwan of ChinaH5N2chicken, duck2004PakistanH7N3chicken2004AmericanH7N2,H5N2chicken2004CanadaH7N3chicken2004South AfricanH5N7ostrich2004VietnamH5N1chicken2005ThailandH5N1chicken, chicken2005IndonesiaH5N1、H7N1chicken, quail2005Korea ,DPRH7N7chicken2005CambodiaH5N1chicken2005ChinaH5N1chicken2005RussiaH5chicken2005TurkeyH5chicken2005RumaniaH5chicken2005ColumbiaH9chicken2005GreeceH5chicken2005CroatiaH5chicken2005SwedenH5chicken2005JapanH5chicken, duck2005EnglandH5chicken2005KuwaitH5chicken2005UkraineH5N1chicken, duck, goose20051.1易感人群及易感动物1.1.1易感人群 任何年龄均具易感性，但12岁以下儿童发病率较高，病情较重。与不明原因病死家禽或感染、疑似感染禽流感家禽密切接触人员为高危人群。在对家禽饲养、宰杀、处理的工作人员、医务人员、患者的家庭成员的研究中检测到了H5的抗体，表明他们感染了H5N1亚型流感病毒，但这些病例都没有出现严重的临床症状。有研究表明，家禽饲养工人的抗体阳性率为10% ,宰杀、处理家禽的工作人员抗体阳性率为3% 梁之祥人感染高致病性禽流感研究近况J,实用医药杂志,2006,23（4）：485-487.。1.1. 2易感动物 很多禽类都能感染禽流感病毒，火鸡最敏感，鸡次之，鸭、鹅和鸽多呈隐性感染。国外报道已发现野鸟、水禽、海鸟等均可感染禽流感病毒，带病毒的鸟类达88种，我国在17种野鸟中发现禽流感病毒。不同日龄、品种和性别的鸡群均可感染发病，但以产蛋鸡群多发。发病康复的鸡群仍属易感动物，不少鸡群发病恢复期间或康复后12个月又发病。康复鸡体内的抗体是有一定限度的，康复后的鸡体中的抗体水平随时间推移逐渐下降，当下降到一定水平时，就不能保护鸡体免受禽流感强毒的侵袭，此时若环境中有禽流感强毒存在，鸡群仍有可能再次感染发病。但同一鸡群第二次发病时，往往症状较轻，死亡率较低。1. 2传染源 对于禽类而言，主要为患禽流感或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，特别是鸡。禽的分泌物和排泄物、组织器官、禽蛋中均可带有病毒，但不排除其他禽类或猪成为传染源的可能。通常认为野生迁徙的水禽，特别是野鸭是禽流感病毒的自然宿主，能将病毒传播给家养和贩卖的禽群2。人禽流感患者是否为传染源，尚无定论。1.3传播途径 对于禽类而言，AIV主要通过横向传播，即通过易感禽类与感染禽类的直接接触或与病毒污染物的间接接触，例如被污染的饮水、飞沫、饲料及其他被污染的蛋筐、蛋盘、运输工具、污染的羽毛和粪便等。该病能否垂直传播，目前尚无足够的证据，但从自然感染禽流感病毒的鸡蛋蛋黄、蛋清及蛋壳中均能分离到病毒。候鸟和野鸟在传播禽流感过程中也可能起到重要作用。 对于人类而言，AN主要经呼吸道传播。禽的分泌物和排泄物、组织器官、禽蛋中均可带有病毒，粪便中含病毒量最大，是禽流感传播的主要媒介。通过密切接触感染的禽类及其分泌物、排泄物、受病毒污染的水以及直接接触病毒株被感染。虽然不能完全排除禽流感在人之间相互传播的可能性，但目前尚缺乏人与人之间传播的确切证据2。1. 4临床 禽类的禽流感潜伏期一般较短，通常为45天，体温急剧上升至43.344.4。根据禽类的种类(鸡、火鸡、鸭、鹅及野鸟等)以及病毒亚型的不同，表现各种各样的变化:有最急性、急性、亚急性及隐性感染等。高致病性禽流感潜伏期短、传播快、发病急、发病率高，死亡率高，但传播范围往往不大。禽流感病毒感染鸡精神沉郁、拒食，病鸡很快陷于昏睡状态，眼脸头部浮肿，肉冠、肉垂出血发组、坏死，脚鳞出现紫色出血斑，有些颈部出现向后扭转的神经症状。病鸡多呈急性死亡，有的也可能出现呼吸道症状，咳嗽、打喷嚏，气管出现咯音，流泪，侧鼻突肿大等症状，羽毛蓬松，产蛋率下降，高致病性禽流感病毒可引起100%的鸡群发病，75%以上的病鸡死亡;无致病性禽流感病毒则不引起任何症状，仅能从感染鸡的血清中检测出禽流感病毒抗体;禽群感染温和型禽流感病毒后，临诊上则以精神沉郁、采食减少、有呼吸道症状、稀便呈黄绿色、产蛋下降、零星死亡为特征田纯见,林志雄,毕英佐,等禽流感预防和控制新进展J,养禽与禽病防治,2006（3）：6-7.。 主要的病变特征为口腔、腺胃、肌胃角质膜下层和十二指肠出血，胸骨内面、胸部肌肉、腹部脂肪和心脏均有散在性出血，头部颜面、肉冠、肉垂浮胖，皮下胶样浸润、出血、心包积水、心肌软化，腺胃乳头出血，脾、肝脏肿大出血，肾肿大，法氏囊水肿呈黄色，生殖系统卵泡畸型、萎缩。低致病性禽流感潜伏期长，传播慢，病程长，发病率和死亡率低，一旦发病，如不采取积极措施，病毒很难在疫区被根除，疫情会逐渐向周边地区扩散，使疫区越来越大，而且病毒还有变强(变成高致病性禽流感病毒)的可能。禽流感因病毒毒株毒力不同，潜伏期和发病率、死亡率差异很大。有的病毒毒株感染后不表现出临诊症状，当遇到强应激时才表现明显的临诊症状。以H9N2,H9N3为例，病程可达2个月之久，主要引起产蛋鸡发病，雏鸡和育成鸡多呈隐性感染或不感染，发病率有的可达100%，多数在80%以内。若无继发感染，死亡率较低，一般在10%以内。由于病程长，发病鸡群发病及恢复期间均能源源不断地随呼吸道、消化道排泄物及羽毛、皮屑等向外界排毒，使鸡舍周围环境中病毒密度很高，条件适宜(如刮风、运输病鸡或其排泄物)时病毒就会不断向周边扩散。传播速度因条件及病毒毒株毒力不同而不同。禽流感的临床症状与病理变化易与新城疫、急性禽霍乱、传染性支气管炎、衣原体、产蛋下降综合征等混淆，且常继发或并发感染，使疾病更加复杂。人类感染禽流感后，潜伏期一般为13天，通常在7天以内。急性起病，早期表现类似普通型流感。主要表现为发热，体温大多持续在38. 5以上，热程17天，多为34天，可伴有流涕、鼻塞、咽痛、咳嗽、头痛和全身不适，常在发病15天后出现呼吸急促以及明显的肺炎表现。部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状1,2。重型患者病情发展迅速，发病1周内很快进展为呼吸窘迫，肺部有实变体征，随即发展为呼吸衰竭，即使接受了辅助通气治疗，大多数患者仍然死亡。亦有以严重腹泻为主要表现，随后出现抽搐、昏迷的个案报道Ungchusak K, Auewatakul P, Dowell S F et al. Probable person-to-person transmission of avian influenza A(H5N1)J . N Engl J Med,2005 ;352 : 333-340,Tran T H, Ngnyen T L, Nguyen T D et al. Avian influema A( H5N1)in 10 patients in VietnamJ . N Engl J Med , 2004 ; 350 : 1179-1188.。大多数H7N7毒株感染者以结膜炎为主要表现。人禽流感进展快、预后差，可出现急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征等多种并发症。常死于严重呼吸衰竭。1. 5影响发病率和死亡率的因素 禽流感的发病率和死亡率与病毒毒株的毒力及感染禽的种类、龄期、性别、环境因素、饲养状况、有无并发、继发疾病等因素有关。其中病毒毒株毒力影响最大，高致病力的毒株可引起100%的发病和死亡，有的毒株不引起任何临诊症状和死亡。饲养管理不当、营养不良、环境条件太差及强应激都会使发病率和死亡率明显增高，有并发感染时，死亡率明显增高。1. 6禽流感多并发或继发其他传染病禽流感本身也是一种免疫抑制性疫病，发病鸡群抗病能力极差，往往并发或继发其他传染病，常见的并发和继发病有大肠杆菌病、新城疫、传染性支气管炎、霉浆体病等。1. 7发病季节 禽流感大流行不同于季节性暴发。季节性暴发主要由已存在于鸡群的流感亚型引起，而禽流感大流行则由流感病毒新亚型或长期未出现的亚型引起。季节性暴发一年四季均可发生，但多暴发于冬、春季节，尤其是秋冬、冬春之交气候变化大的时期。一般情况下夏季发病较少，多呈零星发生，发病鸡群的症状也较轻。 AIV被认为是人类流感病毒的祖先，是几乎所有A型流感病毒的基因库。AI的暴发和流行，将增加AIV与人流感病毒发生基因重排的机会，增加新流感病毒产生的几率，对人类的健康构成了潜在的威胁。2AIV的分子生物学特征 流感病毒为正黏病毒(Orthomyxo Virus)，根据该病毒的核蛋白(NP)与基质蛋白(MS)抗原性不同分为A,B,C三型。A型感染温血动物(禽类和人、猪、马、海洋哺乳动物等),B和C型主要感染人，C型也可感染猪。造成危害的禽流感病毒主要是A型。 AIV是流感病毒属的一个成员，为8节段的负链单股RNA病毒。这8个节段RNA分别编码10个与病毒结构和功能有关的蛋白质，节段1和2分别编码多聚酶蛋白PB1和PB2;节段3编码PA蛋白，也与聚合酶活性有关;节段4码血凝素蛋白(HA);节段5编码核衣壳蛋白NP;节段6编码神经氨酸酶(NA);节段7编码基质蛋白M1和M2，可作为支架蛋白，与病毒的形态有关;节段8编码非结构蛋白NS1和NS2，有可能参与病毒基因组的转录。根据病毒表面的2种糖蛋白HA和NA可将AIV分成若干亚型，目前已从禽类分离到的AIV至少有16种HA和9种NA，这些抗原又以不同的组合，产生极其多样的毒株。不同的H抗原或N抗原之间无交叉反应，且不同亚型的毒株对禽类的致病性是不同的。 历史上高致病性的禽流感都是由H5和H7引起的，但并非所有的H5和H7都是强毒。AIV的抗原性不断发生变异(抗原性转移和抗原性漂异)，这些变异是由HA,NA及PB2引起的，尤其是HA的变异最为常见。 AIV有8个基因组片段，当2个或2个以上的不同病毒粒子同时感染一个宿主细胞时，在病毒的增殖过程中，不同病毒粒子的8个基因组片段可以随机互相交换，从而发生核酸片段水平上的重新组合，这种现象称为基因重排。如果HA和NA基因能够随意重排，16种HA和10种NA则可产生160种不同亚型的AIV，当细胞感染2种不同的AIY后，通过基因片段的重排有可能产生256种遗传学不同的子代病毒或毒株。在自然界，这种混合感染的现象很常见，通过基因重排有可能产生高致病力的毒株。近年来，人们对高致病力AIV H9的分子遗传学关系的研究也比较深人。 对A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)(GDl/96)HA及A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因进行了克隆和序列分析陈化兰,于康震,步志高.一株鹅源高致病力禽流感病毒分离株血凝素基因的分析J.中国农业科学,1999;(32);287-292.,贾永清,陈化兰,邓国华,等.禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96( H5N1) HA基因序列分析J.中国预防兽医学报，2000;22(1);25-30.，结果表明，这2个毒株高度同源，并且与引起世人震惊的香港禽流感事件中人体分离株A/HongKong/156/97(H5N1) (HK156)起源关系非常密切，具有相似的生物学特性。为进一步阐明早于香港禽流感事件，在我国华南地区与香港毗邻的广东发病鹅体中分离到的高致病力AIV GD1/96与香港禽流感事件分离株HK156及香港地区流行株的关系，对GDl/96分离株进行全基因序列分析，并进行了数据分析和比较性研究张建林,于康震,陈化兰,等.禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)全基因序列分析J.中国预防兽医学报，2000;22(3):232-235.，结果表明，鹅体AIV分离株GD1/96为典型的高致病力AIV，与1997年在香港致人感染发病甚至死亡的HK156株的HA基因组结构高度同源(高于98% )，两者在HA切割位点处的6个连续碱性氨基酸残基的插人序列完全一致，均为一PQR-ERRRKKR-，且在受体结合位点的氨基酸序列也相同，说明它们拥有共同的祖先，都起源于欧亚群系，与其他4株具有代表性的香港流感病毒分离株(人、鸡、鸭和鹅各1株)比较，也发现了类似的规律。 GD1/96分离株的NA基因片段与4株香港AIV相比，无19个氨基酸残基(57个核苷酸残基)缺失，即使不包括这些缺失的核昔酸，它们的同源率也较低(核营酸序列、氨基酸序列的同源率分别在88. 5%89. 4%和91. 7% 92. 9%)，而4株香港AIV毒株之间的同源率较高(99. 4%以上)。GD1/96分离株与4株香港AIV的NA基因片段同源率差异更加显著，核苷酸序列、氨基酸序列的同源率分别在71. 4%71. 9%和63. 9%66. 9%之间，说明它们分属于不同的NA基因群系。 除NA以外的内部基因NP,M( M1和M2 ) ,PA,PB1,PB2的核苷酸、氨基酸序列的同源性，GD1/96分离株和4株香港AIV的差异都比较大。 由此表明，1996年内地H5N1病毒分离株GDl/96与1997年香港禽流感事件的发生明显缺乏直接的联系，GD1/%传播到香港引起人、禽的发病是不可能的。不仅如此，对GD1/%分离株的遗传演化分析结果也表明，GD1/%分离株的内部基因起源与香港H5Nl亚型流感病毒不同。目前，在香港地区H9N2亚型AIV遗传演化上存在有2个相对独立分支的亚群G1群以A/Quail/HongKong/G1/97 (H8N2) (QHKGl)为代表的和G9群以A/Chicken/HongKong/G9/97 ( H9N2) ( CHKG9)为代表的，其中的G1群与香港H5亚型流感处在一个进化分支，尤其是分离株QHKG1与1997年香港禽流感事件中分离到的H5亚型AIV直接相连，为H5亚型流感病毒基因重排提供了内部基因，香港H5亚型AIV与分离株QHKG1的内部基因的同源率超过94%，而与CHKG9和DHKY280内部基因核苷酸的同源率仅为88%Guan Y, Shortxidge K F, Krauss S et al. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: Were they the donors of the internal genes of H5N1viruses in HongKong 7. Proc Natl Acad Sci USA ,1999;96:9363-9367.。经分析表明，GD 1 /96分离株与QHKGI , CHKG9和DHKY280之间的内部基因M,NP、PA,PB1核苷酸序列的同源性介于两者之间，并没有明显差别，NA基因也分属于2个NA基因群。据此可以推断，GD1/96分离株的内部基因起源于香港G1亚群和G9亚群的可能性不大。Liu等对近年来分离自我国大陆12个省的23株AIVH9的HA基因进行了克隆及序列分析，并与Gen-Bank上的31株AIV H9进行了核昔酸序列和推导的氨基酸序列比较，结果表明，我国分离的23株AIV H9 HA的核苷酸序列(94.1%100%)和推导的氨基酸序列(94. 5%100 %)同源性很高，而与其他分离株差异显著，说明我国大陆的23株分离株可能有共同的起源。3AIV致病性的分子生物学基础 历史上，高致病性的禽流感均由HS , H7亚型AIV所致。Senn等用RT-PCR和循环测序技术，对76个HS和H7亚型AIV血凝素(HA)切割位点氨基酸序列进行了测定。结果表明，所有高致病性的HS,H7亚型AIV都有多个碱性氨基酸与HA切割位点相毗连，B-X-B-R ( B-碱性精氨酸或赖氨酸，X-非碱性氨基酸，R一精氨酸)是高致病力病毒HA切割位点的最小基序。尽管致病力是AIV的一个多基因特性，但也与其HA糖蛋白切割位点有多个碱性氨基酸相关。存在于大多数真核细胞中的细胞内枯草溶菌素样内切蛋白酶，可促进HA的切割活化作用，而特异性细胞蛋白酶识别并切割不同病原型HA糖蛋白的能力决定病毒在宿主中的传播。由于宿主的大多数细胞均有内切蛋白酶，因此，HA切割作用范围广，进而导致严重病变和高死亡率。而非高致病力病毒HA切割位点只有一个碱性氨基酸(精氨酸)，但也有例外，如1株非高致病力的H7( A/Pekin robin/CA/30412-5/94)病毒的HA切割位点有4个碱性氨基酸，符合高致病力AIV HA切割位点的分子特征，被认为是潜在的高致病毒株。 由此可见，HA切割位点碱性氨基酸序列能作为鉴定高致病力和潜在高致病力分离株的遗传标记。Subbar等对人体中分离的香港H5N1( A/HK/157/97)分离株的HA切割位点氨基酸序列进行了测定，表明其符合高致力病毒的分子特征;通过与禽源H5N1分离株HA基因进行比较发现，两者同源性极高，所不同的是A/HK/157/97缺少1个糖基化位点并推测这可能是AIV得以感染人的可能原因。 Seo等最新的研究认为. Seo S H, Hoffmann E, Wester R G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responsesJ . Nat Med, 2002;8 (9):950-954，细胞遭到流感病毒袭击后，通常会释放出被称为“细胞因子”的免疫分子，激发免疫系统攻击病毒、保护未受感染的细胞。但是，细胞因子(干扰素、肿瘤坏死因子)对引起禽流感的“H5N1”病毒完全视而不见。并认为1997年肆虐我国香港的H5N1 AIV，能够靠1个变异基因掩藏自己，躲避人体免疫系统的攻击。有人发现了H5N1中这个特殊的基因即非结构基因(Non-structural gene , NS )，其NS1分子的第92位为谷氨酸，认为是它使该病毒具有躲避免疫系统攻击的能力。有人将NS基因移植人另一种AIV ( Hl N1 )，用来感染实验猪，结果发现，被改造后的病毒感染的猪发病症状比受未改造的病毒感染的猪要严重得多，病情也持续得更长。科学家的这项发现，将有助于了解对人敏感的H5N1 AIV。 1997年之前，H5N1亚型禽流感即在亚洲的某些地方存在。一开始它的致病力并不强，仅引起轻微症状。但在鸡群中经过数月循环后，其致病性明显增强，可在48小时内致死感染鸡只，死亡率达100%(W HO , 2005)。4AIV的诊断 对禽流感的诊断，以病原分离和血清学检查为依据。病原的分离和鉴定可以从活体或尸体分离病毒。用棉拭子法常可从活体的气管和泄殖腔中分离到病毒。血清学检查的常用手段有琼脂扩散试验、血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验等。4. 1 AIV的分子诊断技术 目前，通过设计合成AIV的核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)基因特异引物，建立了可以直接从临床病料的感染组织中检测所有亚型AIV的RT-PCR诊断技术. 刘明,于康震,崔尚金,等. RT-PCR快速诊断禽流感的研究J.中国预防兽医学报,2000;22(3):182-185.,. Starick E, Romer-Oberdorfer A, Wemer O. Type- and subtype-specific RT-PCR assays for avian influenza A viruses (AIV)J, J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2000;47(4) :295-301.。试验表明，它可应用于所有亚型禽流感感染的早期快速诊断，具有敏感、特异、快速的特点。另外，为特异、快速地检出可引起高致病力禽流感大暴发的H5或H7亚型AIV的感染，还建立了对临床病料或鸡胚接种物中HS和H7亚型r1IV快速分型检测的RT-PCR诊断技术. 崔尚金,陈化兰,唐秀英,等.禽流感RT-PCR诊断法的建立J.中国畜禽传染病,1998;20(20):105-107，H5和H7亚型AIV分型诊断技术在特异地检出H5或H7亚型AIV感染的同时，还可根据应用特定引物经RT-PCR扩增出的H5和H7包括裂解位点在内的HA基因片段、经测序推导出的氨基酸序列，判断HS或H7亚型AIV的致病性高低，为禽流感尤其是高致病力禽流感的防制提供先进、有效的早期快速诊断技术和监测手段，同时也为高致病力禽流感的防制争取到极为宝贵的快速反应时间。 另外，Wang等. Wang X, Castro A E, Castro M D et al. Production and evaluation criteria of specific monoclonal antibodies to the hemagglutinin of the H7N2 subtype of avian influenza virus J. J Vet Diagn Invest, 2000;12(6);503-509.通过对野外分离株H7N2 HA的分离纯化，SP2/0-AgI4骨髓瘤细胞与免疫鼠脾细胞融合建立杂交瘤细胞，获得了6株能稳定分泌抗AIV HA的单克隆抗体，研究为建立更加敏感、特异、快速检测 AIV的分子免疫学方法奠定了坚实的基础。秦爱建等. 秦爱建，邵红霞，钱琨,等.抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异单克隆抗体的研制及应用J.中国预防兽医学报,2003;25 ( 3) :161-163以H5和H9亚型AIV分别免疫BALB/。小鼠，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用血凝抑制试验(HI)检测细胞培养上清，结果获得6株特异性单克隆抗体。研究结果表明，所有这些单克隆抗体仅与试验的相应H5,H9亚型病毒株发生特异性反应，而不能与别的病毒或其他亚型AIV起反应;应用单克隆抗体能在24小时内迅速检测出相应的AIV 。4. 2 AIV的鉴别诊断 由于禽流感的流行特点、症状及病理变化与某些禽的传染病相似，必须及时做出鉴别诊断。如鸡新城疫、传染性气管炎、传染性喉气管炎、传染性鼻炎、支原体病、衣原体病、产蛋下降综合征等;特别是某些疾病的混合感染或继发感染，使病情更为复杂，给诊断带来困难或容易发生误诊。因此，类症鉴别诊断十分重要。 首先是与新城疫(ND)的区别诊断。禽流感与鸡新城疫的流行特点、症状、病变很相似，可从如下几个方面来鉴别:一般来说高致病性禽流感的潜伏期和病程比国内目前发生的新城疫为短，新城疫病鸡呼吸困难，嗦嚷和口中积液，呼吸困难时的咕咕叫声，典型的神经症状等各种表现、常规的典型病变都较禽流感明显和具有特征性，现场新城疫的紧急免疫效果等，都与禽流感不同。但有的也无明显的不同，两病的准确区别诊断，只能依靠实验室的诊断，最简便、实用的方法是病毒分离和血凝抑制试验( HI) , ND抗血清抑制不了AIV的血凝作用。 禽流感与其他几种疾病的鉴别，根据其流行特点、症状、病理剖检和实验室检查(病原学、血清学)等综合分析，是可以区别开的。同样，继发或并发细菌病或病毒病时，通过病原分离和某些实验室检测方法便可确定。4. 3高致病性AIV鉴定标准OIE(国际兽疫局)新标准分离的A型流感病毒，用0.2m11:10稀释的无菌尿囊液静脉或肌肉注射8只48周龄易感鸡，10天内的死亡率不低于75 % 。对所有低致病的H5,H7毒株，血凝素切割位点氨基酸序列与高致病性禽流感病毒一致。 H5, H7以外的A型流感病毒，可致死15只鸡，在缺乏胰蛋白酶的情况下，能在CEF细胞上生长形成蚀斑。 根据AIV毒株致病性的强弱不同，将AIV分为非致病性毒株(Non pathogenic avian influenza virus,NPAIV)、低致病性毒株(Lowly pathogenic avian influenza vinis,LPAIV)和高致病性毒株(High patho-genic avian influenza virus , HPAIV )。有关HPAIV鉴定的标准，目前仍主要依据美国动物卫生协会家禽和其它禽类可传染性疾病委员会制定的标准来进行。其鉴定标准是:无菌的感染性鸡胚尿囊液作1: 10稀释后静脉接种8只4-8周龄易感鸡，0. 2mV只，接种后10天内6/8;毒株为HS或H7亚型AIV，虽然不能致死6/8或以上的鸡，但HA切割位点氨基酸序列与HPAIV相一致;病毒即使是非H5或H7亚型AIV，若能造成1/8-5/8的鸡死亡，而且能在无胰蛋白酶的细胞培养物中生长繁殖，产生细胞病变或蚀斑。符合以上三个条件中任何一条，均可判定为HPAIV 。5禽流感的预防和控制种种迹象表明，由禽流感引起下一次人类流感世界大流行似乎不可避免。因此，如何做好禽流感的预防控制是当前的燃眉之急。AIV疫苗的研究对AI的防制具有非常重要的意义。由于病毒抗原的多变性，目前应用的常规灭活疫苗免疫效果尚存在一些问题，有待开发安全、有效的基因工程疫苗。国内外有关AIV亚单位疫苗、重组活载体疫苗及DNA疫苗研制成功的报道不少。我国采用HS亚型HA和NA基因，经杆状病毒表达，构建了HS亚型基因重组杆状病毒昆虫表达亚单位疫苗和成功研制了表达禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) HA和NA基因的重组痘病毒rFPV-HA-NA活载体疫苗，初步动物试验结果已显示出良好的免疫保护原性，免疫后对高致病力H5N1,H7N1的攻击产生100%的保护. 乔传玲,姜永萍,李呈军,等禽流感重组禽痘病毒rFPV-HA-NA活载体疫苗的研究J.免疫学杂志,2003;19(1):46-49.,. 乔传玲,于康震,邓国华,等禽流感病毒A/Gaose/Guandong/3/96( H5N1) NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建J.中国兽医学报,2003;23(2):111-114.。开展了禽流感HA基因疫苗脂质体的研究，以脂质体转染技术构建了H7亚型AIV HA基因重组鸡痘病毒，并对其进行了免疫保护性研究，结果表明，H7亚型AIV HA基因的重组禽痘病毒可诱导鸡产生有效的免疫保护反应，肠道排毒显著减少. 陈吉祥,李广林,陈化兰,等.禽流感HA基因疫苗脂质体的制备及理化性质J.中国兽医学报,1999;19(3);230-232.。在H5 , H7亚型AIV HA基因重组禽痘病毒研究的基础上，H5,H7亚型NA基因重组禽痘病毒载体疫苗和H9亚型AIV HA基因重组禽痘病毒研究也获得成功. 马文军,张建林,陈化兰,等.禽流感血凝素基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护性研究J.中国农业科学,2000;33(5):75-77.。 我国研制的H7亚型血凝素基因DNA疫苗，在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反应，并有效阻断同源低致病力AIV在机体内的感染和排毒. 陈化兰,于康震,田国斌,等。DNA免疫诱导鸡对禽流感病毒的免疫保护反应J.中国农业科学,1998 ;31(5 ) :63-68.,. 陈化兰,于康震,田国斌,等.禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA人疫苗的免疫原性J.中国兽医学报,1997;17(6);555-558.；研制的H5亚型HA基因DNA疫苗，具有良好的免疫原性，肌肉注射途径即可达到对同源强毒攻击的免疫保护，并能有效阻断免疫保护存活鸡机体的排毒。另外，抗病毒药物对预防AIV也具有非常重要的意义。据报道，美国已研制出一种新型抗病毒药物RWJ-270201，它对人流感病毒和香港感染人的AIV均有效. Http; /China. alibaba. com。目前为止的防治经验表明，全球各国对禽流感作为人和动物共患病采取严格的防治对策，得到了有效控制。在怀疑有禽流感发生时，均采取快速诊断、严格隔离封锁和同群扑杀等综合措施。 禽流感病毒对热的抵抗力较低，56 30分钟，60 10分钟，70 2分钟即可灭活，普通消毒剂均有很快杀死病毒的作用。低温冻干或甘油保存可使病毒存活多年。5.1控制传染源加强禽类疾病的监测，一旦发现禽流感疫情，动物防疫部门立即按有关规定进行处理，并封锁疫区。高致病性禽流感疫点周围半径3公里范围划为疫区，将疫点及其周围3公里的家禽全部扑杀;对疫区周围5公里范围内的所有易感禽类实施疫苗紧急免疫接种，是目前最有效的控制措施。加强对密切接触禽类人员的监测，当这些人员中出现流感样症状时，应立即进行流行病学调查，采集病人标本并送至指定实验室检测，以进一步明确病原，同时应采取相应的防治措施. 高致病性禽流感防治技术规范J,河南畜牧兽医,2006,27（2）：42-45.。5. 2切断传播途径接触人禽流感患者应戴口罩、戴手套、穿隔离衣，接触后应洗手。要加强检测标本和实验室禽流感病毒株的管理，严格执行操作规范，防止医院感染和实验室的感染及传播。注意饮食卫生，不喝生水，不吃未熟的肉类及蛋类等食品;勤洗手，养成良好的个人卫生习惯。5. 3保护易感人群因禽流感病毒高度易变，目前尚无上市的H5N1疫苗。对密切接触者必要时可试用抗流感病毒药物或按中医药辨证施防。在禽流感流行区，与鸡、鸭或其他动物接触时建议:避免与任何有生病、被宰杀或可能感染禽流感动物的鸡场、鸭场或其他动物养殖场接触;如果无意中接触了病鸡或死鸡的环境，应彻底洗手，并连续7天监测自己的体温，如果发热(体温38)，应咨询是否需要接受抗病毒治疗;如果接触了死于禽流感的死鸡或其粪便，应连续7天监测自己的健康状况并向医生寻求帮助. 马震,杜玉梅浅谈禽流感的预防和控制J,养殖与饲料,2006（1）：39-42.。5.4提高疫苗研制水平，争取在流感大爆发期间以最短时间研制出有效疫苗禽流感引发下一次流感大流行似乎势不可挡，那么一旦爆发禽流感病毒在人类的流行，病毒疫苗接种仍然是公认的最有效方法。流感病毒疫苗的接种可以有效降低病人的发病率和死亡率. WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza Pandemics. WHO/CDS/CSR/RMD/2004. 8。但由于流感病毒基因突变和基因重配所造成的抗原漂移和抗原转换，大流感之前所制造的流感疫苗所起的作用微之又微。最有效的疫苗应该是流感爆发后用流行株所制备的特异性疫苗。 流感疫苗的使用已有60年，在使用过程中逐渐完善了其良好的安全性和有效性。在美国，只有两种人用流感病毒疫苗获得许可，即灭活疫苗和减毒活疫苗。传统的疫苗制造过程一般进行“2 +6”模式的病毒重配(即流行野生株的HA和NA基因加上A/PR/8/34病毒株的六个内部基因)，然后将重配病毒接种鸡胚使其传代扩增，最后提纯和浓缩等步骤，过程耗时且繁琐。新近发展起来的反向遗传技术(reverse genetic system)应用于人用及禽用疫苗制造相对于传统疫苗研制方法显示出多项优势:该技术只需设计构建相关质粒，然后转染293T细胞或Vero细胞、接种鸡胚扩增病毒即可，步骤简便，疫苗制造周期短，可以在大流感流行期间快速制造出特异性疫苗;该技术可以使疫苗含有标准化的抗原含量(standardized antigen content);该技术不需要传统技术所必须的浓缩、纯化病毒步骤，不会致死鸡胚，从而大大节约成本。通过剔除H5亚型禽流感病毒HA分子的多重碱性氨基酸序列，可以使该技术制造的疫苗具有良好的安全性. Webeter R G. Microbial adaptation and change; avian influenza J.Rev aci tech Off Int Epiz, 2004; 23:453-465.。综上所述，可以预见，一旦大流感爆发，反向遗传技术必将在疫苗制备中发挥重要作用。2005年2006年WHO推荐在北半球使用的裂解疫苗标准病毒株包括A/New Caledonia/20/99(H1N1),A/California/7/2004/ (H3N2)以及B/Shanghai/361/2002，这3种疫苗组合可以使被接种者获得对H3N2,HIN1甲型流感及B型流感的免疫力，但这些推荐使用的疫苗对禽流感H5N1并无防护作用. 韦天彬,黄裔腾,李康生.禽流感病毒的变异进化及其预防控制J.中国免疫学杂志,2006,22(1)：16-19.。5.5加大对抗流感病毒药物的储备，重点保障高危人群用