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高效液相分析方法开发分享 梁杏 HPLC方法建立前的准备工作 分析样品的结构 熟悉样品的基本性质 查阅文献 有类似的方法可参考借鉴 无类似的方法可借鉴 紫外吸收 分析结构 正向或反相色谱进行分离 流动相的选择等 紫外检测器 蒸发光散射检测器 目录 色谱柱的选择检测波长的选择流动相的选择梯度的优化其他 一 色谱柱的选择 基本要求 有较高的理论塔板数 能提供更好的分离度 色谱柱的基本要素 填料 柱长 粒径 直径 例如 5 m填料的色谱柱长要250mm 3 5 m填料的柱长要150mm等等 柱长和粒径小了 流速增加很多 能节约分析时间 提高工作效率 填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑 普通的分析柱都在100A左右 能满足分析检测需要 1 API分析方法开发 需要做色谱柱的筛选实验 最少使用三种不同类型的色谱柱 每种类型三只 要求来自不同厂家 Waters Agilent Phenomenex 2 制剂分析方法选择色谱柱与API相似 但筛选实验较简单 一般根据样品性质直接选取一两只普通C18或者其他色谱柱进行比较 我们现有的色谱柱 1 用于胶原蛋白大分子含量测定 SymmetryC185 0 m4 6mm 250mm100A Waters 2 用于氨基酸分析的 AccQTagForHydrolysateAminoAcidAnalysis3 9mm 150mm Waters 3 用于外部校正 SupersilODS25 0 m4 6mm 250mm 依利特 4 新柱子 Symmetry300C185 0 m4 6mm 250mm Waters 专柱专用 二 检测波长的选择 紫外扫描 将样品配制成一定浓度 在紫外分光光度计上扫描 最大吸收处的波长作为检测波长 二极管阵列检测器 DAD PDA 做色谱峰纯度检查和选择检测波长 三 流动相的选择 流动相的有机相 一般选择甲醇和乙腈 流动相的优化 优化主要在水相上做改变 水里加酸 加盐 从而改善峰型 提高分离度 常用的酸有磷酸 三氟乙酸 甲酸 乙酸等 通过加酸改变流动相的PH值 从而改善样品的分离度和峰形 色谱柱主要都是硅胶基质 会造成样品峰拖尾 低PH帮助抑制硅胶基活性 减小拖尾 水溶液中添加0 1 的磷酸或者TFA其PH值大概2左右 所以液相分析方法时首选水加0 1 的磷酸或者TFA 然后再以此为基础做优化 单独使用酸不行就要考虑使用缓冲盐 选择原则 简单 稳定 缓冲能力强 需要调PH值时要有相应的酸或碱 常用的缓冲盐 磷酸盐 钾盐 钠盐 醋酸盐 盐浓度在10 20mM左右 使用缓冲盐时要注意流动相混合后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题 流动相的优化 流动相调整小秘诀 秘诀一 由强到弱秘诀二 三倍规则 每减少10 的有机溶剂 保留因子约增加3倍 秘诀三 粗调转微调 四 梯度的优化 梯度的优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间 优化样品的分离度 有机相起始比例越小 样品保留时间越长 随着梯度的变化 样品出峰的先后顺序也有可能改变 在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在 为了提高样品的分离度 尽量使用大比例的水做梯度的起始 对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时不能有盐析出 例 氨基酸分析流动相A 醋酸盐 磷酸盐缓冲液流动相B 色谱乙腈流动相C 纯化水