电泳技术在生化分离领域的运用.doc

电泳技术在生化分离领域的运用电泳技术在生化分离领域的运用 ABC 摘摘 要要 电泳技术 是指在电场作用下带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异 而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术 在生化分离领域 主要运用的电 泳技术包括凝胶电泳 薄膜电泳 等电聚焦等 本文将着重介绍毛细管电泳和凝胶双向电 泳的运用 关键词关键词 双向凝胶电泳 毛细管电泳 生化分离 Applications of Electrophoresis in the Field of Biochemistry Separation ABC Department of Chemical and Biochemical Engineering Xiamen Univeristy Xiamen 361005 China Abstract Electrophoresis is a method basically used for separating macromolecules such as nucleic acids or proteins in terms of molecular sizes electric charges and other physical properties under applied electrical field This paper introduces the development of the electrophoresis technique discusses some important methods including gel electrophoresis film electroprssis isoelectric focusing and so on The applications of the two dimensional electrophoresis and the capillary electrophoresis are analyzed in detail Key words Two dimensional electrophoresis capillary electrophoresis biochemical separation 前前 言言 许多生物分子都带有电荷 但由于混合物中各种组分所带电荷性质 电荷数量以及相 对分子质量的不同 在同一电场的作用下 在一定时间内各组分移动的距离不同 从而达 到分离鉴定各组分的目的 这是电泳的基本原理 从 19 世纪开始的电泳技术研究到现今电 泳技术在生化分离领域的广泛运用 先后出现了胶体电泳 滤纸电泳 凝胶电泳 和目前 广受重视的毛细管电泳等多种电泳技术 作为生化分离 分析的重要手段 电泳技术在稳 定性 分辨率和保持产物活性方面已取得了巨大的进步 当然还存在着电泳结果不能直接 分析 必须进行染色 而不同蛋白质与染料的结合差异较大 还不能广泛应用质谱技术 高敏感检测技术直接分析双向凝胶电泳结果 实现分析自动化等问题 本文介绍了电泳技 术的原理 发展和现状 并着重分析了目前广泛运用和研究的毛细管电泳以及双向凝胶电 泳 展望电泳技术将不断发展 日渐完善 1 电泳技术的产生 发展与现状电泳技术的产生 发展与现状 1809 年俄国物理学家 首次发现电泳现象 他在湿粘土中插上带玻璃管的 正负两个电极 加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊 即带负电荷的粘土颗粒向 正极移动 这就是电泳现象 1909 年 Michaelis 首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳 他用不同 pH 的溶液在 U 形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点 1937 年瑞典 Uppsala 大学的 Tiselius 对电泳仪器作了改进 创造了 Tiselius 电泳仪 建 立了研究蛋白质的移动界面电泳方法 并首次证明了血清是由白蛋白及 球蛋白 组成的 由于 Tiselius 在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了 1948 年的诺贝尔化学奖 1948 年 Wieland 和 Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法 对氨基酸的 分离进行过研究 从本世纪 50 年代起 特别是 1950 年 Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后 开创了利用各种固体物质 如各种滤纸 醋酸纤维素薄膜 琼脂凝胶 淀粉凝胶等 作为 支持介质的区带电泳方法 1959 年 Raymond 和 Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质 创建了聚丙烯酰胺 凝胶电泳 极大地提高了电泳技术的分辨率 开创了近代电泳的新时代 30 多年来 聚丙 烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质 多肽 核酸等生物大分子使用最 普遍 分辨率最高的分析鉴定技术 是检验生化物质的最高纯度 即 电泳纯 一维电泳 一条带或二维电泳一个点 的标准分析鉴定方法 至今仍被人们称为是对生物大分子进行 分析鉴定的最后 最准确的手段 即 Last Check 由 80 年代发展起来的新的毛细管电泳技术 是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展 己受到人们的充分重视 1 1 毛细管电泳的产生和发展毛细管电泳的产生和发展 毛细管电泳技术 Capillary Electrophoresis CE 又称高效毛细管电泳 HPCE 或毛 细管分离法 CESM 毛细管电泳方法虽新工艺 但历史悠久 它是在电泳技术的基础上 发展的一种分离技术 电泳作为一种技术出现 已有近百年的历史 但真正被视为一种在 生物化学中有重要意义的技术 是由 1937 年 A Tiselius 首先提出 传统电泳最大的局限 是难以克服由高电压引起的焦耳热 1967 年 Hjerten 最先提出在直径为 3mm 的毛细管中做 自由溶液的区带电泳 Capillary Zone Electro phoresis CZE 但他没有完全克服传统电泳 的弊端 现在所说的毛细管电泳技术 CE 是由 Jorgenson 和 Lukacs 在 1981 年首先提出 他们使用了 75mm 的毛细管柱 用荧光检测器对多种组分实现了分离 1984 年 Terabe 将 胶束引入毛细管电泳 开创了毛细管电泳的重要分支 胶束电动毛细管色谱 MEKC 1987 年 Hjerten 等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行 同年 Cohen 发表了毛细 管凝胶电泳的工作 近年来 将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中 又发展了电色谱 扩大了电泳的应用范围 1 2双向凝胶电泳的产生和发展双向凝胶电泳的产生和发展 双向电泳由 O Farrell s 于 1975 年首次建立并成功地分离约 1 000 个 E coli 蛋白 并表 明蛋白质谱不是稳定的 而是随环境而变化 目前 随着技术的飞速发展 已能分离出 10 000 个斑点 2 电泳的基本原理电泳的基本原理 2 1 电泳原理电泳原理 电泳技术 是指在电场作用下 带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而 有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术 许多生物分子都带有电荷 其电荷 的多少取决于分子结构及所在介质的 pH 值和组成 由于混合物中各种组分所带电荷性质 电荷数量以及相对分子质量的不同 在同一电场的作用下 各组分涌动的方向和速率也各 异 因此 在一定时间内各组分移动的距离也不同 从而达到分离鉴定各组分的目的 2 2 电泳方法的分类电泳方法的分类 2 2 1 按分离原理分类 1 区带电泳 电泳过程中 不同的离子成分在均一的缓冲液体中分离成独立的区带 这是当前最广泛的电泳技术 2 移界电泳 是最早建立的电泳 它是在 U 型管中进行的 由于分离效果较差 已 为其他电泳技术所取代 3 等速电泳 必需用电泳仪 当电泳达到平衡后 各区带相分成清晰的界面 并以等 速移动 4 等电聚焦 由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场中 自动形成 pH 梯度 使被分离物移动至各自等电点的 pH 处聚集形成很窄的区带 且分辨率较高 2 2 2 按有无固体支持物分类 1 自由电泳 1 显微电泳 也称细胞电泳 是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为 2 移界电泳 3 柱电泳 是在层析柱中进行 可利用密度梯度的差別 使分离的区带不再混合 如再配合 pH 梯度则为等电聚焦柱电泳 4 自由流动幕电泳 5 等速电泳 2 支持物电泳 其支持物是多种多样的 也是目前应用最多的一种方法 其电泳过程可以是连续 的或是不连续的可进行常压电泳 高压电泳 免疫电泳 等电聚焦电泳及等速电泳 根据支持物的特点又分为 1 无阻滯支持物 如滤纸 醋酸纤维薄膜 纤维素粉 淀 粉 玻璃粉 凝胶颗粒等 2 高密度的凝胶 如淀粉凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂或 琼脂糖凝胶 3 电泳技术的应用 电泳技术的应用 电泳技术主要用于分离各种有机物 如氨基酸 多肽 蛋白质 脂类 核苷酸 核酸 等 和无机盐 也可用于分析某种物质纯度 还可用于分子量的测定 电泳技术与其他分 离技术 如层析法 结合 可用于蛋白质结构的分析 指纹法 就是电泳法与层析法的结 合产物 用免疫原理测试电泳结果 提高了对蛋白质的鉴别能力 电泳与酶学技术结合发 现了同工酶 对于酶的催化和调节功能有了深入的了解 所以电泳技术是生化分离领域中 的重要研究技术 3 1 电泳技术的常用方法电泳技术的常用方法 3 1 1 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳 纸电泳用于血清蛋白质分离 1 已有相当长的历史 在实验室和临床检验中都曾经广泛 应用 自从 1957 年 Kohn 首先将醋酸纤维薄膜用作电泳支持物以来 纸电泳已被醋酸纤维 薄膜电泳所取代 因为后者具有比纸电泳电渗小 分离速率快 分离清晰 血清用量少以 及操作简单等优点 醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯 由该物质制成的薄膜称为 醋酸纤维素薄膜 这种薄膜对蛋白质样品吸附性小 几乎能完全消除纸电泳中出现的 拖 尾 现象 又因为膜的亲水性比较小 它所容纳的缓冲液也少 电泳时电流的大部分由样 品传导 所以分离速度快 电泳时间短 样品用量少 醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液 或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存 3 1 2 琼脂糖凝胶电泳 琼脂经处理去除其中的果胶成分即为琼脂糖 由于琼脂糖中硫酸根含量较琼脂为少 电渗影响减弱 因而使分离效果显著提高 例如血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条 区带 脂蛋白 脂蛋白 而琼脂糖凝胶电泳可将血清脂蛋白分出三条区带 脂蛋 白 前 脂蛋白和 脂蛋白 所以琼脂糖为较理想的凝胶电泳的一种材料 琼脂糖凝胶 孔径较大 对一般蛋白质不起分子筛作用 但适用于分离同工酶及其亚型 大分子核酸 2 等应用较广 由于凝胶是透明的 因此可与免疫法技术结合进行免疫电泳和对流免疫电泳 3 1 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶 PAGE 是一种人工合成的凝胶 具有机械强度好 弹性大 透明 化 学稳定性高 无电渗作用 设备简单 样品量小 1 100ug 分辨率高等优点 并可通过 控制单体浓度或单体与交联剂的比例 聚合成不同孔径大小的凝胶 可用于蛋白质 核酸 等分子大小不同的物质的分离 定性和定量分析 还可结合解离剂十二烷基硫酸钠 SDS 3 以测定蛋白质亚基的相对分子质量 是目前分离分子的最好方法 其分离是 以物质的物理差异 分子大小和净电荷为基础的 即分离除了利用物质所带电位的差别外 还具有分子筛的特殊作用 这种性质为分开电泳率很相近的大分子提供了简单有效的方法 例如用它进行血清蛋白质分离时 可以分离出几十个区带 分辨率很高 其它电泳方法则 通常只能分离出5 6条区带 除此之外 多肽SDS PA GE 和含尿素的多肽SDS PA GE 4 都是很好的分离小分子质量多肽 5 20 ku 的电泳方法 3 1 4 等电聚焦电泳技术 IEF 等电聚焦是 60 年代中期问世的一种利用有 pH 梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的 电泳技术 由于其分辨率可达 0 01pH 单位 因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同 的蛋白质组分 在等电聚焦的电泳中 具有 pH 梯度的介质其分布是从阳极到阴极 pH 值逐渐增大 如前所述 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征 这样在碱性区域蛋白质分子带负电 荷向阳极移动 直至某一 pH 位点时失去电荷而停止移动 此处介质的 pH 恰好等于聚焦蛋 白质分子的等电点 pl 同理 位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动 直到它 们的等电点上聚焦为止 可见在该方法中 等电点是蛋白质组分的特性量度 将等电点不 同的蛋白质混合物加入有 pH 梯度的凝胶介质中 在电场内经过一定时间后 各组分将分 别聚焦在各自等电点相应的 pH 位置上 形成分离的蛋白质区带 3 2 最新电泳技术在蛋白质分离中的运用最新电泳技术在蛋白质分离中的运用 3 2 1 双向凝胶电泳技术 随着后基因组时代的到来 对许多生物体的研究已经进入蛋白质组学研究阶段 蛋白 质组 proteome 是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质 1994 年由澳大利亚学者Wilkins 和Williams 首次提出 5 蛋白组研究的手段主要是高通量双向 电泳 2DE 进行蛋白质的分离 再由专业计算机软件进行图像分析 然后通过质谱技术 及蛋白质数据信息处理技术对凝胶上的蛋白质进行分离和鉴定 其中一个关键步骤就是细 胞或样品中蛋白质的分离 目前最佳的方法就是2DE 传统的单向电泳方法最多只能分析 100种蛋白质样品 而一块典型的2DE胶大约能分离2000个蛋白点 最好的大约能分离 10000多个蛋白点 6 1975 年 O Farrel 首先建立了等电聚焦 SDS 聚丙烯酰胺双向凝胶电泳 IEF SDS PAGE 分离和分析蛋白质组分的技术 这一技术应用两个不同分离原理依据蛋白质的特性 进行分离 7 第一相依据蛋白质所带电荷量的不同 用等电点 PI 聚焦技术分离蛋白质 在此方法中引入固定p H 梯度技术 IPG 可以实现等电点仅有0 01 pH 单位差别的蛋白质 的分离 从而大大提高了分析的灵敏度 第二相是依据蛋白质分子量大小的差别 通过蛋 白质与SDS 形成复合物后 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率不同达到分离蛋白质的目的 虽然O Farrel 于1975 年就采用蛋白双向电泳法进行蛋白质的分离及检验 但当时采用两 性电解质载体 carrier ampholyte 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 从而限制了蛋白双向电泳的稳定 性及可靠性 随着近来技术的进步与更新 蛋白双向电泳在不同方面得到改进与完善 尤其 是固定pH梯度胶 immobilized pH gradient 概念的出现 采用固定于塑料支撑条上的固定 pH 梯度胶代替过去的两性电解质载体毛细管胶进行蛋白等电聚焦 这大大地提高了蛋白 等电聚焦的分辨率与稳定性 根据第一向等电聚焦条件的不同 可将2 DE 分为三种方法 第一种方法是在丙烯 酰胺胶中进行 两性电解质在外加电场作用下形成pH 梯度 该方法称为ISO DALT 其 主要缺点pH梯度不稳定 上样量低 重复性差 不利于不同实验室间进行图谱比较 如果 第一向电泳使烯酰胺和固相化的两性电解质immobilines 商品名 8 共聚 可形成具有pH 梯度的凝胶 这种方法IPG DALT 系统 是现在主要和常用的方法 该方法的优势表现在 9 1 pH 梯度稳定 聚焦确 精度高 梯度分辨率可以达到0 001pH 目前在一块胶 上最多可分离10300 多个点 2 无阴极漂移及碱性蛋白丢失的现象 3 蛋白上样量大 可以提高低丰度成分的分辨效果 4 样品中盐的干扰少 无边缘效应 5 pH 梯度和分 离结果的重复性好 第三种方法是非平衡pH 梯度电泳 nonequilibrium pH gradient electrophoresis NEPhGE 主要用于碱性蛋白的分离 鉴于分辨率 重复性的限制和IPG DAL T分离碱性蛋白的优势 NEPhGE 电泳已不是分离碱性蛋白的优选方法 10 蛋白质点染色最好采用自动凝胶染色仪编制程序进行染色 11 它使染色各个操作步骤 的时间 温度 染色盘的振荡控制有较高的可控性和重复性 进而使2DE 胶染色有较好的 可比性 便于后续的2DE 胶分析 但由于自动凝胶染色盘中溶液的体积受限制 对于较厚 和较大的凝胶洗涤不彻底 致使染色背景较深 这时最好采用大染色盘 保证需要比较的 凝胶在同一条件下染色 染色后 使用高分辨率的扫描仪 对电泳后的湿胶直接扫描 可 避免干燥保存后固缩造成的波纹对凝胶图像分析的影响 随着超灵敏度质谱技术的发展 发现双向凝胶电泳并不能将所有蛋白质完全分离 许 多斑点仍为两个或更多蛋白的混合物 此外 在其应用中仍然存在很多局限 1 样品上 样量小 使蛋白检测的灵敏度受到限制 2 电泳结果须经染色处理 不能直接分析 并且不同蛋白质与染料的结合差异较大 3 分子量过大 100000 过小 10000 不 适于此法分离检测 4 一些疏水性膜蛋白 12 常常是很多药物作用的靶点 因不能溶于 提取溶剂而不适合上样于凝胶电泳 5 目前 尚不能实现完全自动化处理 6 实验结 果表明当蛋白质的拷贝数低于1000时 双向电泳技术是不能分辨出来的 为了分析低拷贝 蛋白质 必须简化样品的处理步骤 减少蛋白质的流失 可应用超声组织粉碎仪 超速离 心机等措施 提高蛋白质的提取量 13 3 2 2 毛细管电泳 CE 技术 毛细管电泳是目前广泛应用的高效分离分析技术 CE 与高效液相色谱 HPLC 一样同 是液相分离技术 很大程度上CE与HPLC 互为补充 但无论从效率 速度 用量和成本 来说 CE 都显示了它的优势 CE 没有泵输运系统 成本相对要低 且可通过改变操 作模式和缓冲液成分 根据不同的分子性质 如大小 电荷数 手征性 疏水性等 对极 广泛的物质进行有效分离 相比之下 为达到相同目的 HPLC 要用价格昂贵的柱子 和溶剂 毛细管电泳的主要优点 14 有 极高的分离性能 其每米的理论塔板数为几十万 到100 万以上 远高于离子色谱 超微量进样 其进样量为纳升级 快速简便 毛细 管区带电泳适用于小离子的测定 其峰容量是离子色谱法的10 倍 如可在30 s 内完成对 样品中硝酸根和亚硝酸根的测定 15 毛细管电泳仪的结构及操作也比离子色谱简单 试 剂消耗少 维持费用低 对环境污染少 相对于离子色谱 其所用毛细管的价格远低于色 谱柱 EC应用于蛋白质组的研究 主要包括 16 17 1 毛细管区带电泳 CZE 主要依据 不同蛋白质的电荷质量比差异实现分离 CZE可以实现阴阳离子的同时分离 但对中性组 分无分离效果 2 毛细管等电聚焦 C IEF 用两性电解质在毛细管内建立pH 梯度 使 各种不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置 形成一条非常窄的聚焦区带 可用于测定蛋白质的等电点 分离异构体和其他方法难以分离的蛋白质 分离效果与双向 凝胶电泳结果相关性良好 3 筛板 SDS CE 依据SDS 蛋白质复合物在网状骨架中 迁移速率的不同实现分离 CE 对蛋白质的分离与双相凝胶电泳比较 可以实现在线自动 分析 并可用于分子量范围不适于双相凝胶电泳的样品分析 缺点在于复杂样品的分离尚 不完全 4 毛细管电色谱 CEC 18 是将HPLC 发展起来的众多固定相填充到毛细管中或 涂敷在毛细管壁上 使之如同色谱固定相一样参与分离 可以说CEC 是CE 与HPLC 的 有机结合 既有CE 的高柱效 又有HPLC 的高选择性 利用涂层还可有效减少生物大 分子如蛋白分子在毛细管壁的吸附 改善峰形 提高选择性 是一种很有发展前景的模 式 5 胶束电动毛细管色谱 MECC 是在电泳缓冲液中加入离子型表面活性剂 如十二 烷基硫酸钠 SDS 当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时 表面活性剂分子之间 的疏水基团聚集在一起形成胶束假固定相 通过分离对象在胶束相和水相之间的分配系数 不同而实现分离 胶束电动毛细管色谱的突出优点是不仅能分析离子化合物 还能分析不 带电荷的中性化合物 把电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物 从而拓宽了毛 细管电泳的应用范围 19 6 为了满足大批量样品的分离要求 特别是在人类基因组和蛋 白组计划中的应用 20 毛细管阵列电泳 CAE 的分离模式渐渐呈现出了广阔的应用发展前 景和趋势 与传统聚丙烯酰胺凝胶板电泳可以进行多道平行分析相似 毛细管阵列电泳即 是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析的一种分离模式 随着芯片技术的发展 电泳芯片尤其引起了人们的关注 毛细管电泳的分析模式几乎 都可能转移到芯片平台 21 Manz 等 22 最早报道了基于电泳芯片分析的PCR 方法 之后 电泳芯片被广泛应用于PCR产物分析及DNA 测序等 Li 等已经成功地将电泳芯片与质谱 联用分离检测蛋白质水解产物 23 他们把CE 芯片与纳电喷雾质谱联用 建立一套 chip2CEPQqTOF MS 系统用来分析痕量膜蛋白 样品处理简单 只需一维电泳分离 水解 成肽段后直接进样 分离时间不到1 5 min 毛细管电动色谱芯片也已被提出 用于多多肽的 分离 24 作为DNA 测序最重要的 在蛋白质分析中也广泛应用的检测器 激光诱导荧光 LIF 检测 发展尤其迅速 一系列新的荧光标记试剂不断研究出来 柱前标记 在柱标 记及柱后标记等多种标记方法也逐步成熟 25 虽然毛细管电泳有很多优点 但其缺点也是明显的 26 毛细管电泳法检测目标物质的 原理是同一缓冲液中不同离子运动速率的差异 这是不同离子在同一缓冲液中形成不同离 子区带的基础 同样 由于不同离子运动速率的差异 其形成的区带的宽度不同 单位体 积缓冲液中离子的数量不同 造成了先期到达的离子区带 紧实 峰形尖削 而后面到达 的离子形成的区带不明显 单位体积缓冲液中离子的数量小 因此当这种 松散 区带经过 检测窗口时需要的时间长 峰矮而胖 与基线的界限不明显 造成待测物质的检测不准确 甚至困难 该技术运用于细胞和细胞组分分析领域还存在许多难点 27 如 缓冲液的选择 对细胞颗粒电泳时候完整性的影响 如何保证每次细胞进样量的恒定 不同细胞中同一成 分的含量不同对单细胞分析是否有影响 如何选择对照的指标等等 都值得进一步探讨 毛细管电泳今后发展方向仍是继续提高分辨率 速度和检测器的选择性 同时 增加自动 进样装置和使之微机化 商品化 另外 将它与质谱仪更好地结合 可对生物分子特性作 出更快 更准确的分析 以进一步拓宽毛细管电泳在生物领域的应用范围 3 3其它电泳技术在生化分离领域的运用其它电泳技术在生化分离领域的运用 3 3 1等速电泳法检测无机和有机阴离子 28 毛细管电泳法可同时分离检测多种阴离子 具有高效 快速等特点 等速电泳法也可 以同时分离检测多种阴离子也有其优点 1 区带界面有 自身校正 效应 两个区带界 面清晰 因此等速电泳法有较高的分辨率 2 对低含量样品 等速电泳法具有自富集效 应 监测限较低 3 易与其它技术联用 3 3 2 介体电泳技术 介体电泳技术 preparative electrophoresis 是生物纯化技术的一个革命 它将电泳分离 技术的原理与膜过滤分离技术的原理的相结合 利用分子的大小和其所带电荷的性质不同 对复杂的生物溶液进行纯化 浓缩和盐析 澳大利亚著名科学家Joel Margolis 即第一块 梯度电泳胶的构思者 根据介体电泳技术原理发明了Gradiflow仪 29 经过10 多年的研制 和改进后 于1998年开始进入市场 介体电泳技术的优越性具体体现在 30 减少了生 物活性物质的降解 纯化条件温和 无强酸强碱 强电解质溶液 无高压 可在适宜的温 度下操作 纯化费用低 操作容易 Gradiflow仪无需柱子 电泳胶 无需高压 梯度 处理和冷冻室 且仪器设备的价格低廉 产量高 纯化时间短 纯化速度可达80 gPh 31 32 纯化的同时可进行浓缩和脱盐 所以适用于未经加工的原溶液 因每次更换新 的分离膜片 无交叉污染 Gradiflow仪在纯化的同时可以除去病毒 细菌和内毒素等 病原体 3 3 2单细胞凝胶电泳 SCGE 单细胞凝胶电泳 SCGE 又称彗星试验 comet assay 是由Ostling等 33 于1984 年首次 提出 并利用该技术在中性条件下检测 射线引起的DNA 双链断裂 1997年 Santos 等 34 首次将SCGE 技术与DNA 荧光原位杂交技术 FISH 结合起来 为SCGE 技术的应用开 辟了新的途径 我国朱志良博士率先在国内建立了彗星2荧光原位杂交技术体系 并利用该 技术体系发现人9 号染色体是苯代谢产物的靶染色体 2001 年 Nadin 等 35 建立了SCGE 银染法 进一步提高了损伤DNA 分析的灵敏度 其原理是 36 包埋在琼脂糖凝胶中的细 胞经裂解和解螺旋 使断裂的DNA 碎片进入凝胶 在电场作用下 带负电荷的DNA 断片 向阳极迁移 形成彗星影像 由于该方法具有敏感 简便 快速 低耗等优点 广泛应用 于遗传毒理 环境监测 临床 饮食以及氧化应激和细胞凋亡的研究 4 展望 展望 运用电泳技术解决生化分离中的各种难题 已取得重大进展 双向凝胶电泳和毛细管 电泳更是近年来研究的重点 但是要应用于实际领域 还有很多问题尚待解决 就当前进 展来看 今后的研究主要集中在以下两个方面 1 质谱技术 高敏感检测技术直接分析 双向凝胶电泳结果 实现分析自动化 当前 各种自动化电泳分析仪 如美国Helena 公 司PEP SPIEF 全自动电泳系统 法国Sebia 公司Hydrasys 全自动电泳技术等 多采用半干 技术 检测灵敏度高 特异性强 重复性好 仅需1 2h就可获得清晰结果 且胶片干后可 保存 目前还在推广中 2 以CE HPLC MS MS 技术取代传统双向凝胶电泳 实现 上样 分离 分析的完全自动化 因此 随着电泳技术的不断深入研究 其在生化分离过 程的运用将日臻完善 参考文献参考文献 1 游力书 范俊源 贾永辉 氨基酸纸层析和纸电泳分析的新改进 化学通报 1994 3 5 10 2 黄建军 饶贤才 胡晓梅 对琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段的有效性的再认识 第三 军医大学学报 2001 26 1 5 10 3 陈丹华 蛋白质凝胶电泳及其分析应用 分析科学学报 1995 11 3 5 10 4 左爱军 梁东春 郭刚 多肽的电泳分离 Tianjin Med J 2004 32 10 5 10 5 Wilkins M R Pasquali C Appel R D From Proteins to Proteomes Large Scale Protein Identification by Twodimensional Electrophoresis and Aminoacid Analysis Biotechnology 1996 14 1 61 65 6 王新 王伯良 张宗友 蛋白质组分析中双向电泳技术的改良和应用 细胞与分子免疫 学杂志 2001 17 2 5 10 7 赵从建 刘少君 郭尧君 蛋白质组分析的开门技术双向电泳 北京 化工出版社 2000 8 郭尧君 郭强 目前最高分辨率的电泳 固相pH梯度等电聚焦 生物化学与生物物理 进展 1994 21 2 5 10 9 胡莉萍 沈岩 双向凝胶电泳技术 蛋白质组学与基础和临床医学 国外医学 分子生 物学分册 2001 33 2 118 121 10 张国庆 廖杰 于力方 双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用 标记免疫分析与临床 2003 10 3 5 10 11 刘建军 房师松 李习艺 蛋白质组研究技术平台的建立双向电泳条件的建立及优化 卫生研究 2004 33 3 5 10 12 张曼 蛋白质组学研究中的核心技术双向凝胶电泳 现代医学 Modern Medical Journal 2004 32 4 5 10 13 李义良 朱华清 张红锋 双向电泳技术 生物学教学 2004 29 4 5 10 14 金良 甘莉 毛细管电泳在蛋白质和核酸分析研究中的应用 华中农业大学学报 2003 22 1 73 76 15 Melanson J E Lucy C A Ultra Rapid Analysis of Nitrate and Nitrite by Capillary Electrophoresis Journal of Chromatography A 2000 884 311 316 16 毛煜 徐建明 毛细管电泳技术和应用新进展 化学研究与应用 2001 13 1 5 10 17 姜旭淦 陈盛霞 毛细管电泳技术及其在生物分子研究中的应用进展 江苏大学学报 医学版 2004 14 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