珙桐遗传多样性1.docx

在此处输入文章标题1.3琪桐的研究现状及本研究的目的与意义1.3.1我国特有珍稀树种琪桐的研究现状琪桐povidianivoulcraatBaillon)系我国特有的琪桐科琪桐属植物，其起源古老，为第三纪古热带植物区系的孑遗种。由于其树姿优美、花序奇特好似白鸽展翅，故有“中国鸽子树”之美称。琪桐于1869年由法国人岱维斯首次发现，原列为蓝果树科，1955年.ALTakhtajna和.HL.Li认为琪桐子房6一10和蓝果树科显著不同，创建了琪桐科，向桂琼等(向桂琼，198外李凤兰等(李凤兰，1998)曾分别从植物化学成分角度和解剖学角度对琪桐和蓝果树科植物喜树进行了比较，结果验证了这一观点。琪桐在植物系统发育和地史变迁研究上有很高的学术地位，目前仅在我国西南地区有星散状分布，现己被列为国家一级保护珍稀濒危植物(傅立国和多鉴明，1992)。同时也是世界上著名的园林观赏树种。洪桐具有很高的经济价值，种子、果皮都能榨油，油呈黄色，半干性，味道浓纯、清香，是优质的食品油，也可作为工业用油，据测定，果实内含油量达47%一67%，还是食品加工用的香料，果内皮可提炼香精;果核含蛋白质14%左右;琪桐木材色白，坚重，细致，纹理通直，不易腐烂，是建筑、家具、模具、室内装修和工艺美术等用材的优质原料;花是密源;树皮与果皮，可提取拷胶或作活性炭原料(唐晓军，2002)。我国对琪桐的系统研究开始于20世纪70年代之后，早期主要进行引种栽培方面的研究，后逐渐扩展深入到区域分布及变迁、群落生态学、繁育及栽培技术、保护对策的提出等方面。但对有关琪桐生理生化、遗传特征、分子生物学等方面的研究不但在我国没有深入开展，而且在整个世界上也鲜有报道。(1)区域分布、变迁及其引种研究琪桐作为一个中国特有种已经面临生存的威胁，摸清资源分布状况，探讨影响其分布的主要因子，进而对其分布趋势和引种范围进行预测，对于更好地保护并利用这一珍贵资源具有重要意义。在第三世纪早期，琪桐的分布可达3秒一38gN的黄河流域，到三世纪晚期琪桐分布可能己经遍及中国滇东北和川西南，并在全世界许多地方广泛分布，由于第四纪冰川作用，琪桐在许多地方遭到灭绝，唯有在中国的西南地区地形十分复杂的的亚热带山地，由于受第四纪冰川作用影响较弱得以残存下来。目前琪桐仅天然分布在我国湖南的西北部、湖北的西部、四川盆地边缘地区、贵州的北部及云南的横断山脉，分布范围位于北纬23叹533呜8，经度范围为99，05川“18，且大都呈星散状分布。但其引种范围却达到了北纬39竹4许久的北京和55“以北的哥本哈根，海拔也从700一1400米下降到50m，充分说明了琪桐是一个适应性强、生态幅度宽的树种(张家勋等，1995)。气候变化、人为干扰是造成琪桐天然保存范围狭窄的主要原因。吴刚等在贵州梵净山对50年内末受人为干扰和在人为强度干扰两种情况下，琪桐种群数量和更新的变化情况进行了调查研究，结果表明在自然环境保存良好的情况下，琪桐种群属扩展种群，种群个体数呈指数增长曲线Y=141.38.0e，4x2变化，而在人为强度干扰、自然环境破坏严重的情况下，琪桐种群属于严重衰退种群，种群个体数呈对数下降曲线Y二一1oo.7ln(x)+178.09变化。张清华等在琪桐地理分布规律研究的基础上应用地理信息系统技术，找出了适宜琪桐分布的气候参数区间，并且确定了琪桐的适宜分布区，结合预测出2030年气候变化的结果，模拟出了琪桐地理分布的变迁，预测出2030年琪桐的适宜分布区将由东向西，由西向东移动，比当前气候条件下减少面积约20%。同时张家勋等通过对琪桐的垂直分布范围研究，估琪桐天然群体的遗传多样性分析及其保存样本策略研究在种群中的作用随时间的推移将逐渐降低，而失去优势种的地位，有成为伴生种的危险(叶其刚等，2000;汪正祥等，2000)，这也是琪桐处于濒危的一个明显表现。从其形成机制上分析，主要是受到繁育方式、生长习性、人为干扰等因素影响，苏智先等对琪桐种群的生殖周期，生殖时间，生殖物候规律及特征，种群的分布特征及群落学特征等进行了研究，研究表明，琪桐种群的幼苗耐阴，成树喜阳，生长迅速，虽其分布小而零散，但在琪桐群落中可见其幼苗、幼树和成树共有现象，且有不同年龄阶段的琪桐个体生长于同一生境中，说明该种群在群落中是较稳定的成员，但人为破坏十分严重，对琪桐种群的生存和繁衍产生巨大影响(苏智先和张素兰，1999)。琪桐群落由于居群间存在诸多隔离因素，基因交流机制被阻断，加之其种群适应机制十分保守，继续深入研究琪桐的群落生态学特性，为保护和繁育措施提供科学依据，对于阻止琪桐在群落演替过程中消失或其它类型的群落所代替具有重要意义。(3)繁育及其栽培技术由于琪桐兼具科学研究、经济、观赏等多种价值，开展琪桐的繁育及其栽培技术研究一直以来是一项重点内容。其繁育方式主要分为有性繁殖和无性繁殖，由于种子外壳坚硬，透水透气性差，采用种子繁殖要注意对种子的处理，张家勋等试验表明物理方法处理琪桐种子，未改变它的发芽时间，但提高了发芽率，这说明班桐种子种皮的机械阻力是影响种子发芽的重要因素，克服种皮阻力是催芽成功的必要条件，同时还提出了变温催芽在琪桐种子催芽中上具有应用前景。由于琪桐的种子有性繁殖很困难，其人工无性繁殖就显得很重要。营养繁殖的技术也较多，如硬枝扦插、嫩枝扦插、埋条、嫁接、高枝压条等方法，其中扦插是主要的方式(黎云祥等，2003)。在扦插育苗技术上，张家勋等指出进行硬枝扦插时最佳选择是:挑选李一年生母树枝条，最好用年生枝条，选择基部直径为.0”一mc枝条作为插穗;祥嫩枝扦插中时间是关键因素，5月上旬扦插成活率最高。飞琪桐的繁殖和栽培是关系到琪桐保护及开发利用的关键因素，但目前研究仅仅中在种子繁殖和扦插育苗上，对于组织培养、嫁接等育苗方法的研究明显不足，力开展相关技术研究是今后一段时间内应着力解决的问题。(4)保护对策研究关于琪桐的保护对策研究，国内众多学者从其天然分布特点，分布区的自然环境概况，群落的区系特点，居群的遗传多样性等方面入手，提出了多项保护策略。重钟为挽救琪桐群落的生物多样性亦即采取措施保护基因、物种、生境和生态系统，章成等提出，目前除了对异地保护的试验林进行深入研究，扩大繁殖和栽培外，点应放在对琪桐原产地的就地保护上(钟章成等，1984)。因为琪桐的移地保护己经失去了许多琪桐原有的遗传多样性，若用它们的嫩枝扦插和嫁接，其本质只是无挑镌瞬醚爵繁鞋戳岸矛算出琪桐理论水平引种距离可达2260KIn，引种范围可达中国大部(张家勋，1995)，这说明积极开展琪桐的引种保护是防止琪桐面积进一步缩小的重要手段，这也将显示出琪桐的引种与保护潜力巨大。(2)群落生态学研究由于群落生态学在生态学中占据重要地位，因此对于琪桐的群落生态学研究开展得相当广泛和深入，在目前琪桐的主要分布区域内，包括琪桐的群落组成与外貌、群落间物种关联性、群落结构与动态方面都有较深入的开展。关于群落组成与外貌:琪桐群落的植物种类十分丰富，在各分布地调查研究表明现存的琪桐群落都表现出种群组成的丰富性、结构的相对复杂性及年代的古老残遗性等特点，但不同分布地其群落组成和结构又各不相同。沈泽昊等对四川卧龙琪桐群落开展了群落调查，共有藻类7科11属14种，裸子植物1科1属1种，被子植物66科143属177种，物种丰度甚至超过了中亚热带中、南部低海拔地区常绿阔叶林相当面积内的物种数量，其中古老植物种类就有20余种(沈泽昊等，1999);艾训儒等对恩施星斗山自然保护区的琪桐群落进行了调查，在1600可样地内共有17科20属32种维管束植物(艾训儒和谭建锡、1999);焦健等在甘肃调查表明，琪桐群落内分布了种子植物169种，分属66科，123属，其中乔木层51种、灌木层36种、草本层65种，属中国特有分布型属的有6属9种(焦健等，1998)。丰富的物种组成和结构对于琪桐群落的繁衍具有积极的意义，但琪桐的物种组成也极易受到人为千扰，喻理飞对受人为干扰严重的贵州柏著喀斯特地区的琪桐群落研究显示，琪桐群落种类少，乔木层仅10一14种，灌木层、草本层种类则更少(喻理飞，2002)。从外貌上看，琪桐群落普遍呈现出明显的北亚热带常绿、落叶阔叶混交林特色。关于群落物种间的关联特性:种间联结是指不同物种在空间分布上的相互关系，通常是由于群落生境的差异影响了物种的分布而引起的。种间联结性的研究有助于了解物种间的关系，正确认识群落的结构特征，探讨环境差异对植物分布的影响，在实践上为物种多样性保护提供种间关系的科学依据。这方面的研究开展得较为普遍。与琪桐呈正相关的物种主要有灰柯、山茶、水青树、包果石栋、千金榆等，呈负相关的物种有绢毛稠李、山矾、水青冈、银鹊、青冈等，但琪桐种群与其主要共生种群间的联结关系均未达到显著程度，这与琪桐群落主要处于成熟林的发展阶段有关，也反映出一些地域琪桐群落的次生性(覃林等，1999)。关于群落结构与动态:琪桐群落结构较为复杂，垂直分层明显，可分为乔木层、灌木层和草本层，在乔木层中一般可分为2一3个亚层，各层盖度从30一9%5不等，草本层盖度多为最高，乔木层次之，灌木层最低，反映了琪桐群落结构的复杂性和稳定性，但单纯从琪桐种群径级结构分析来看，呈明显的倒金字塔形，_种群是以大径级的中老年个体为主;幼小植株少，后备个体缺乏;种群个体数量呈下降趋势，其性群遗传物质的转移，因此要保护琪桐这个物种的多样性，首先应基于对原产地的保护。吴刚等提出保护琪桐的最佳途径是保持它们的生境，具体的策略包括保护对策、恢复对策、重建对策及维持对策。除此之外，还应采取就地保护和异地保护相结合，引种繁殖和物种改良相结合，在保护其遗传基因和物种生物学特性的前提下，增大其对生境的生存适应，拓宽其生态习性.同时，对于人工采摘种子也应该加以限制，这样才能确保琪桐林的正常更新(李建强等，2000)。李建强等通过琪桐的等位酶位点变异分析研究，检测出琪桐居群内和居群间在等位酶位点上的多态性和遗传变异程度、基因交流的程度和水平，为琪桐的保护生物学研究提供了保育遗传学方面的证据，在此基础上提出制定保护策略时要注意:()l在进行迁地保护的同时应加强原产地的就地保护:(2)对人工采摘种子进行限制，保证琪桐林的更新;(3)由于琪桐的遗传多样性绝大多数存在于居群内，各保护点应维持足够数量的个体数。在我国深入开展对琪桐物种的研究的重要性不言而喻，目前的相关研究明显滞后于发展需要。由于琪桐天然分布有进一步缩减趋势，琪桐保护的前景不容乐观，对琪桐的研究还存在诸多不足，主要表现在:有关琪桐的研究主要集中在宏观生态学水平、基本繁育技术及生物学特性描述上，而对其内在的生理发育、遗传分化及相关分子生物学等方面的研究开展极少;就地保护的策略和方法尚需加快研究进度;繁殖技术研究有待向纵深发展;对其群落生态学的研究未能充分揭示琪桐与其它种群间的作用机理;对其遗传多样性的研究基本属于空白，这些方面都鱼待加强。1.3.2研究目的与意义在物种进化动力和机制的研究中，对遗传多样性和遗传结构的探索始终是学科领域中的基本问题(Hartl&clkar1997)。关于这方面的研究使人类通过解读进化历史遗留的遗传信息来推测在过去曾经发生过的历史事件的特征，达到理解生命进化的根本目的。根据目前对物种遗传多样性的研究，地球上生命在分子水平的遗传多U乙咖卜刁et咐网异样性水平一般在巧一50%之间，平均杂合度则在2一巧%之间(shciater199勺。偏离这一比率的遗传多样性(主要是偏低)被认为在历史中存在特殊的遗传变异的进化事件(oBrien，1994)。关于物种遗传多样性的研究不仅只是一种理论上的探索，同时，这类研究广泛而重要的应用前景。目前，应用主要在于自然保护和疾病治疗领域(H洲，愁参akar，1997)。遗传多样性的研究和管理成为保护生物学的核心内容，众多的分子履检测手段被研究者运用于各种不同的生物中。幻mura在20年前提出的要为精确定量突变率、选择系数、有效群体大小和迁移率做出努力，从而最终理解适应(daPat扣)e现象的希望正在实现(木村资生，1983)。琪桐是我国乃至世界倍受青昧的宝贵生物资源，目前有关琪桐遗传多样性瑰斤的研究仅见李建强!，s等利用等位酶对琪桐多个居群的分析，除此之外，至今还没翁琪桐天然群体的遗传多样性分析及其保存样本策略研究人用分子生物学方法进行类似的研究。分子标记技术作为一种日趋成熟的技术，在开展各物种的遗传多样性研究方面己取得了突破性进展，在遗传资源保存策略的制定中、在预测群体变化趋势、合理开发利用植物资源方面产生了巨大作用。利用分子标记技术对琪桐的遗传多样性进行分析，积极开展琪桐分布区内各种群间的遗传变异研究、琪桐种群内的遗传结构分析、以及琪桐种质资源保存策略等方面的研究，对于保护这一中国特有珍贵植物将产生积极的影响，也是一项摆在我们面前的重大课题。因琪桐仅分布在甘肃东南部的文县、陕西西南部的安康地区、湖北的神农架及恩施各县市、湖南的武陵山区、贵州的梵净山、四川的西南部及云南北部共7省40多个县市，分布的纬度范围为北纬23吃533马8，经度范围为99a05In“18，呈星散状分布，现有的原生群落面积十分有限，仅4500mhZ(张清华等，2000)，所以为了科学地制定出对琪桐的保育策略，我国的植物学工作者曾对琪桐的繁殖生物学、栽培技术和群落生态学特征进行了调查研究(王献溥等，1995;贺金生等，1995;杨一川和李体俊，1989)。本研究的主要目的是:1)利用RAPD分子标记技术对分布于我国的5个天然琪桐群体的群体内和群体间的遗传多样性进行检测，从DNA水平上阐明其遗传变异;2)检测不同的取样方法对群体遗传学参数的影响;3)在研究琪桐DNA水平的遗传多样性的基础上，提出我国琪桐种质资源的保存样本策略。琪桐天然群体的遗传多样性分析及其保存样本策略研究本实验所用的随机引物购自Operno公司，DNA聚合酶Taq购自大连宝生物有限公司。dNTP购自上海生物工程公司。2.2研究方法1材料基因组NDA提取和浓度确定材料基因组DNA提取参考DyoelJJ和DoyelJL的CTAB法，其具体步骤如下:()l取新鲜叶片0.19于液氮中迅速研磨成粉末，转入预热的600pICTAB提取液中，65保温15一30分钟，不断振荡摇匀;(2)取出保温样品，冰浴至室温，加入600pl氯仿:异戊醇(24:1)，充分振荡摇匀;(3)在常温下离心10分钟(10000rpm):(4)取上清液，加入等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于一20冰冻2小时;(5)离心10分钟(10000Prm)，弃水相留沉淀使自然风干;(6)加500pnxTE溶解沉淀，再加等体积饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，离心取上清液;(7)在上清液中再加氯仿:异戊醇(24:)l抽提两次，同样离心取上清液;(8)加1/10体积3MNAaC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于一20冰冻2小时;(9)离心10分钟，将液相倒出，加7%0乙醇浸泡2小时，再离心弃液相，使沉淀气干;(10)加适量1xTE溶解沉淀，于一20下长期保存。确定基因组DNA的浓度，是在1%琼脂糖凝胶上电泳2pl所提取的DNA样品，与已知浓度的人DNA比较确定浓度，见图2一1所示。图2一1琪桐样品DNA的浓度Fig.2一1TheconeentrationofDNAofrsamPlesinD.invoulearat华中农业大学博士论文2.2.2RApD扩增方案确定本实验所用的PCR扩增仪为pekrin一Elmer9700。参考杨树等木本植物的RA卫D的扩增条件及反应体系，设定基本反应条件为:94预变性3分钟，然后进入循环:94变性60秒，36一48复性60秒，72延伸2分钟，共40个循环，最后于72延伸7分钟。基本反应体系定为20pl:10倍反应缓冲液Zpl(10m0M，pHS.3，Tris一HCI，50omMKa，10一叨mMMgel:，0.01%Gelatsn)，几q聚合酶i单位，山汀P，dTTp，dcTp，do，各为10伽M，引物0.私M，DNA模板20ng左右。()l针对本实验的植物材料对基本反应条件中的退火温度进行确定:在其它反应条件相同的情况下，设定38，40，42，45，48五个梯度的退火温度，反应体系中Taq聚合酶先定为1单位，Mg+2浓度为2.smM。经过五个梯度的比较，最终确定本实验的扩增反应条件为:94Co94Co45727243minlminlminZmin7min40eycle.1(2)在确定的反应条件下，再对反应体系中的M扩十浓度进行确定:Taq酶先定为l单位，其它反应成分相同，分别配制不同M犷+浓度的10倍反应缓冲液:15mM，18mM，20mM，25mM，30mM和40mM。任选4样品的NDA作为模板，以有扩增产物的随机引物作为引物，通过扩增电泳比较，确定该实验体系中Mg+2的反应浓度以25mM为宜，如图2一2所示.图2一2不同Mg+2浓度比较rigZ2TheeomparisonofdieffernteoncentartionorMgZ+洪桐天然群体的遗传多样性分析及其保存样本策略研究(3)确定Taq酶的用量在确定的反应条件和反应体系中，对Taq酶的用量进行比较定量，分为四个不同的梯度:0.5u/reaetion，0.75u/reaction，1.0u/reaetion，1.25u/reaetion。经过扩增电泳比较，确定本实验的Taq酶用量为1.u0/rae以ino，如图2一3所示。图2一3不同Taq酶的用量比较FigZ3TheeomParisonofdi爪erntdosageofTaqenZyme对上述三个主要因子的比较，确定本实验的RAPD扩增方案，即扩增程序为:起始变性温度步骤943mni循环变性步骤94lmni循环退火步骤45lmni循环变性步骤72Zmni循环周期总数40最后延伸步骤727mni最后保存温度4反应体系为:DNA模板的量:20ng左右Mga:的浓度:25mmol凡dNTP的浓度:200林mol凡Primer的浓度:0.5脚01几Taq聚合酶:1.ou(SU加z)pCR10X缓冲液:20m0m9呱Tris一HCI缓冲液(pHS.3)，soommol几KCI:50林mol几TMACL，0.01%Geleron反应总体积:20林l扩增产物经含有澳化乙锭的1.%2琼脂糖凝胶在1xTEB缓冲液中电泳分离，最后在紫外灯下用凝胶成像系统拍照记录结果。材料与方法1试验材料根据琪桐的分布特点，在甘肃文县、湖北神农架、湖北宣恩、四川峨眉山、贵州梵净山等五个地方，选择具有连续分布特征的天然林分做为研究对象群体，在全林分随机抽取3050株琪桐树(每两琪桐株间距不少于5m0)，分别按单株采集叶片。另外，在湖北宣恩七姊妹山选择SOmx100m的一块琪桐样地，胸径6ncl以上洪桐树木全部分别单株采集叶片，并记录其位置座标。5个群体及一块样地共采集样品240份，其中湖北宣恩40份、四川峨眉山41份、贵州梵净山37份、湖北神农架30份、甘肃文县38份、样地样品54份。琪桐的天然分布区及我们具体采集样品的位置如图2一O所示。每个不同样品采集新鲜叶片，用变色硅胶干燥的方法固定DNA，具体操作如下:采集5一10克新鲜叶片置于一带拉锁的小塑料袋中，再加入50一100克变色硅胶，摇动使叶片与硅胶充分地、均匀地接触，一般来说，硅胶与叶片的比例至少要10:1(w/w)，以保证叶片在12小时之内干燥。在野外一旦发现硅胶从深蓝色变成粉红色要即时更换，干燥的材料带回实验室，室温下保存。LLL。，.1In-二二卜卜一习三又一习一、户缺缺群群阿飞_IJJJ二一连连奋奋奋奋奋lr、玉乙乙乙戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴戴剖剖冬.丈丈丈摇摇爵爵爵爵爵爵111、7一-一一花花于于崔办认./:一)匕匕兰少介粼粼粼塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌塌潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜潜夕二声-/一一，封币币币币币币币币币币币币币币州州州州卜钊、下下下下八广硬艳冬目烤烤烤烤匆匆匆匆礴礴“味一可匕匕匕冲认认咬卜J片片片、工工fffffffffffffjjj.止止止止止一一一一.一，lll，.111图2一0琪桐的天然分布区及样品采集位置图Fig.20ThemaPofD.nivoulcraatdistributingzoneandsamPlingPosition(琪桐天然分布区用.表示，样品采集位置用表示)华中农业大学博士论文2.2.3引物筛选在确定的RA卫D扩增方案下，首先利用一个DNA样品对40个10一碱基的随机引物进行初筛，有扩增谱带且谱带清晰者可用于复筛。对引物进行复筛目的是检测出样品中存在多态性的引物，检测多少样品合适，工作量和成本密切相关，根据期望概率，由下面公式确定所选个体数:n=(l一1/2)魄，其中n为信息损失量，n为所用个体数。如果所用复筛个体数为5，则在所有样品中检测不到多态性的概率为1/32，即可能有%3的信息损失量。本实验是利用5个个体参加复筛，即用5个DNA样品对初筛出来的引物再进行筛选，其中有分离的引物，即可用于最后的全部样品分析，引物筛选如图2一4和图2一5所示图2一4引物初筛Fig.24Theele刃口en扭叮sceren恤9ofPrimesr图2一5引物复筛Fig.2一5TheseeondseereningofPrimesr琪桐天然群体的遗传多样性分析及其保存样本策略研究2.2.4ARDP电泳结果的记录通过一系列RAPD基本程序的操作后，即得到RAPD谱带，对谱带进行分析。RApD扩增产物的命名以前比较乱，后来有人建议采用统一的命名法，现在大多数研究中都是根据所用引物及扩增产物的大小来命名。例如，当用opeorn公司中kitB中第2号引物扩增出一个600bp的多态性片段时，就可以将它定名为OPB一2600。其中，OP表示生产厂家为operno;B表示kiBt;2表示kiBt中第2号引物;600表示扩增产物的分子质量为600bp(刘博林和荆玉祥，1994)。为了便于对RAPD电泳结果进行分析，需将RAPD标记的结果(即谱带)转换成数字形式。对于RAPD标记，只记录具有多态的谱带，对于扩增条带的有或无，一般认为强反应带和重复出现的弱带应记为“1”，而不重复出现的弱带和没有条带的记为“0”，模糊不清或无扩增产物即缺失时记录为“一”，按此方法记录即可得到RAPD反应的原始数据。.22.5数据统计方法对于RApD电泳谱带所得的数据，人们己开发出了一些用于分析这类数据的统计学方法，包括shnnaon信息测量(儿ng.LMetal，1989)、基因多样性统计(NeiM.1973)，或是最近一些专门分析ARpD数据的新方法(ClkarAGetal，1993;切n比Metal，1994)等。本研究是利用popGENE软件包(YehFC，YangR.popGENEv1.31.(1997)doaldorfmht:Ptv/吓阴.ualbeart.c小yfe助对该ARDP数据进行分析。具体分析的参数如下:1)多态位点比例伊尸召夕(pnorortionofpol卿。甲hieloei):尸尸刀二(knf)xloo%，其中k为多态位点数，n为检测到的位点总数。多态位点:具有2个以上等位基因且每个等位基因频率大于.001的位点。2)等位基因频率(allelerfequeney):佘二(Zn。+艺nij)/(ZN)(i#j)ni为具有纯合aiai基因型的个体数，nji具有杂合aiaj基因型的个体数，N为个体总数。3)等位基因观察值(A)(averagenumberofalleles):A二Sain/其中a;为第i个位点的等位基因数;n为测定位点总数。4)有效等位基因平均数卿已):Ne=Snen/，ne=1/spiZ其中ne为单个位点上的有效等位基因数，p;为单个位点上第i个等位基因频华中农业大学博士论文率，n为测定位点总数。5)平均期望杂合度(He)(averageexpeetedheteorzygosity):He=艺hn/，he二i一piZ其中he为单个位点上的杂合度，p;为单个位点上第i个等位基因的频率，n为检测位点总数。He衡量的是群体中基因的多少及其分布的均匀程度，Nei(1973)将其定义为“基因多样度(gneedivesriyt)伍)”，作为衡量群体变异水平的理想参数，也是当前应用最广泛的指标。6)基因分化系数(Gst)o(ceffieientofgenedieffrentiation):Gst二DstH/t=归场殆)傲其中Ht和Hs分别为总群体和亚群体的基因多样度，计算同前述的计算He，但计算Ht时，Pi为第i个等位基因在总群体中的频率(所有亚群体基因频率的平均值)，而计算Hs时，需先计算每个亚群体的He值，Pi为第i个等位基因在该亚群体中的频率，再将所有亚群体He值平均即得Hs，每个位点可得出一个Gst值。该法是建立在分解基因多样度(平均期望杂合度)的基础上即将总群体的基因多样度分解为亚群体内的基因多样度和亚群体间基因多样度两部分，从而求出亚群体内基因多样度占总多样度的比例，以衡量总群体的分化程度。7)基因流伍协衣)g(eneflwo):灿”:(-1Gs)/ztGst8)群体Ide遗传距离(D)(distnaee):D二一玩I这里I二J洲(JxJ种班，又称为遗传相似性系数，表示两群体间的遗传相似程度，其中xJ、JY和JYx分别是所有位点上xj，jy和jxy的算术平均数。这里xj=s茂，j=ysyi.jxy二SXIYi.X*，Y;分别是x、Y群体中第i个等位基因的频率。9)Shnnaon多样性指数(I):=I一SPiofgPZi这里Pi是一条扩增产物存在的频率，即RAPD条带的表型频率，I为表型多样性指数。I可以计算两种水平的多样性:PIpo和PsI，勿叩是群体内平均多样度的测度。PsI是种内多样性。PIpo/PsI则是群体内多样性所占的比例，群体间多样性所占比例则为口，一PI咧/仰。2.2.6数据分析方法RAPD是显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，按扩增阳性()l和扩增阴性(0)记录电泳带谱，形成原始数据矩阵。采用两类方法对该原始数据进行解释。其一是将RAPD标记视为表征性状，直接利用原始二元数据矩阵(表征矩阵)进行计算;其二是将每位点视为两个等位基因M、m，分别为琪桐天然群体的遗传多样性分析及其保存样本策略研究显隐性，因此，数据1代表基因型MM或Mm，数据0代表基因型mm，然后假设群体内基因频率处于Hardy一weinberg平衡，通过隐性基因型(扩增阴性)的频率(qZ)，利用平衡定律pZ+PZq+qZ=1印二显性基因频率，=q隐性基因频率)计算出各基因的频率(基因频率矩阵)后用于下一步统计(APosteletal，1994)。群体遗传结构分析包括群体内遗传变