珠状壳聚糖对茶汤中茶多酚的吸附及解析研究.doc

珠状壳聚糖对茶汤中茶多酚的吸附及解析研究生物与化学工程系 应用化学专业118652009056 苏子达 指导老师 薛丽群【摘要】本论文探讨了在不同条件下珠状壳聚糖对茶多酚的吸附和解析性能。结果表明，在吸附剂珠状壳聚糖用量4g、180r/min、吸附时间4h、茶汤pH7.5、温度30、茶汤质量浓度为1.050mg/mL，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率可达80.63 %，在该条件下壳聚糖对茶多酚的吸附效果最好；而用80%的乙醇作为解析剂、30、180r/min、2h条件下，对吸附茶多酚后珠状壳聚糖的解析效果较佳。【关键词】珠状壳聚糖、茶多酚、茶汤、吸附、解析。1前言茶，是我国文化与生活中不可或缺的一部分，如今茶文化已经风靡全世界。对茶的种植利用可以追寻至数千年之前，茶树喜欢湿润的气候，在我国长江流域以南地区有广泛栽培。茶作为一种健康的养生饮品收到广泛的推崇，加工后的茶叶冲泡饮用具有强心、宁神、排毒以及抗衰老等等功效1。是故茶的种植日渐广泛，产量极其巨大，但在茶叶的加工中难免会产生一定量的茶末、碎屑与废弃枝叶之类的废料，而这些废料与大多数的陈茶的利用方法极为有限，经济价值不高，然而陈茶与新茶的主要保健物质（茶多酚）并无区别，若能对陈茶或废料进行深加工，开发一些茶多酚产品，不仅对废弃物进行资源化，还能提高其经济利用价值。本论文实验的目的就在于，对茶叶中于人体有保健功效的主要物质茶多酚的提取。茶多酚为茶叶内所含的多酚类物质的总称，茶多酚在茶叶中的含量一般在1520像这种数据，最好要有文献标注。，包含有：包括黄烷醇类（儿茶素类化合物）、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类、缩酚酸类多酚化合物的复合体和酚酸类等。而其中占据主要成分的为黄烷醇类化学物质（儿茶素），黄烷醇类化学物质（儿茶素）也是最重要的组成成分，黄烷醇类化学物质儿茶素(C)约占多酚类总量的60%-80%，它主要的组成成分有儿茶素(C)、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸(GA)、表儿茶素没食子酸酯（ECG）等2几种单体。茶叶的许多作用都是因为茶叶中的茶多酚在起作用,它具有：食品保鲜防腐，无毒副作用，食用安全；以及在医学上用于消除活性氧自由基、防癌、防治高血脂血症引起的疾病、提高人体综合免疫能力等等强大功效3-5。所以茶叶中有效成分茶多酚该如何有效健康的提取，一直是很多人研究和展望的方向。目前较为常见的茶多酚提取方法有：溶剂浸提法、金属离子沉淀法、超临界流体萃取法、树脂吸附分离法、超声波浸提法、微波浸提法等4。溶液提取法 6-7 主要是将茶叶用极性溶剂浸渍（如丙酮、乙醚、乙醇、氯仿等），然后把浸取液进行液液萃取分离，最后浓缩得到产品，不过此法茶多酚损失太大收率过低生产成本高，且易造成污染是这些缺点吗？尽量少用“太”或“过”，这种词比较极端。金属离子法是用金属沉淀茶多酚，使其与咖啡碱分离，该法较常用到的金属离子有Ca2+、Fe2+、Mg2+、Al3+、Zn2+等，相较其它方法而言金属离子沉淀法的选择性和产品纯度均较高,标点符号格式不对然而在稀酸转溶过程中茶多酚损失较大，且金属离子沉淀剂都具有一定的毒性，此法所生产的产品难以符合食品和医药行业的要求。超临界流体萃取法CO2 是最常用的超临界流体，相较于以上两种方法，超临界流体萃取法具有萃取温度低、选择性极高、安全无毒等优点，茶多酚在超临界萃取过程中不易氧化，所需产品的纯度高，适合于医药、食品添加剂等产品的要求，然而在超临界CO2中茶多酚的溶解度小，即使加入极性改性剂后提取率仍然很低，极大的限制了该方法的应用。超声波浸提法8-9与常规的溶剂浸提法相比，具有提取温度低、生产耗能少、目标产品得率高 、氧化损耗小等特点。曹雁平等10用双频复合超声提取绿茶中的茶多酚，在浓度、提取率和提取速率方面都优于单频超声法。而微波提取法也是利用物质分子在微波场中的特殊效果11，减少茶多酚在高温下的氧化，提高产品品质与得率，然而该法对其组分有一定影响。树脂吸附分离法具有工艺简单、操作方便、能耗少 、作条件温和、免了有效成分失活。而且该方法的溶剂乙醇是无毒、无污染、回收容易，所用的吸附剂壳聚糖可再生、成本较低，有利于实现大规模生产。罗志敏12等进行珠状壳聚糖树脂对绿茶浸出液中茶多酚的吸附，在其最优的实验条件下的吸附率高达74.1%，单位吸附量可达136.1mg/g。壳聚糖是环保型的天然生物材料，来源丰富、无毒、无污染，具有生物可降解性和良好的生物相容性13。壳聚糖树脂微结构具有疏松、多孔性等特性，且表面含有羧基、氨基等功能基团，可以有效的对茶多酚进行提取分离。并且氨基聚合物还可以通过疏水键对茶多酚进行吸附14，而且通过此法生产的产品使用安全性比较容易有保证，这对医药、食品、化妆品等工业更有特殊的重要性。本论文实验使用珠状壳聚糖对绿茶中的茶多酚进行吸附，并对其吸附条件进行了实验讨论，还对其进行吸附动力学方面的初步探讨。2 实验部分2.1 实验仪器与药品2.1.1 药品与试剂壳聚糖，浙江玉环澳兴生物科技有限公司；甲醇（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；三蒸水；蒸馏水；盐酸，乙酸，硫酸，无水乙醇，酒石酸钾钠，硫酸亚铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾等均为市售分析纯，乙腈为市售色谱纯。2.1.2 仪器7200型分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；pHS-3C型精密酸度计，上海虹益仪器仪表有限公司；88-1大功率磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；H.H.S型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TH2-C台式恒温振荡器，太仓市华美生化仪光厂；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；prostar-210高效液相色谱仪，美国瓦里安；SHB- 循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；AUY220型分析天平，日本岛津；UV-1750型紫外可见分光光度计，日本岛津；电子万用炉，天津市泰斯特仪器有限公司。2.2实验内容2.2.1 珠状壳聚糖的制备以100ml 1%的醋酸溶液溶解4g壳聚糖，配制成浓度为4%的壳聚糖醋酸溶液。以医用注射器将溶液匀速滴于凝结液（20%的NaOH与30%的甲醇以8：2的比例混合均匀）中，以得到颗粒大小均匀，形状规整，具有吸附能力的球形壳聚糖，于凝结液中静置一夜，而后水洗至中性，泡于蒸馏水中下保存备用。2.2.2壳聚糖膜对茶多酚的吸附性能研究2.2.2.1茶汤的制备称取3g的已研磨成碎屑的茶叶试样（精确到0.0001g）于500mL的锥形瓶中，加入450mL煮沸的蒸馏水，然后塞上塞子移至沸水浴中浸提45分钟（每隔10分钟摇动一次），浸提完毕后要立刻趁热减压过滤，并将滤液移入500mL容量瓶中，待冷却后用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。2.2.2.2 茶多酚的定量方法按GB/T 83132002方法测定茶多酚的含量。茶多酚（%）= 式中：L1试液的总量，mL；L2测定时的用液量，mL；M0试样的质量，g；m试样干物质含量，%；A试样的吸光度；1.957用10mm比色杯，当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于1.957mg。2.2.2.3 茶多酚的吸附研究按茶汤的制备方法制得茶汤，分别吸取25mL用移液管取溶液，有效数字要准确。是25.00mL论文相关的地方均要改。，然后按规定测定加入珠状壳聚糖前的茶汤中茶多酚的含量a，然后取茶汤25mL于100mL锥形瓶中，加入适量珠状壳聚糖，置于恒温水浴振荡器（180rpm）中吸附一定时间，再按规定测得珠状壳聚糖吸附后的茶汤中茶多酚的含量b茶多酚的吸附率p(%)=2.2.2.4 茶多酚的解析研究吸取25mL茶汤，在最佳吸附条件下用珠状壳聚糖吸附茶汤。获得吸附后的珠状壳聚糖。并按规定测得被吸附后茶汤的茶多酚的含量，加入不同解析剂，置于恒温水浴振荡器（180r/min）中解析一定时间，再按（2.2.2.2）规定测得解析出来的茶多酚的含量。茶多酚的解析率p（%）=2.2.3 HPLC检测条件按GB/T 8313-2008方法使用液相色谱仪检测。色谱条件：色谱柱，ODS-3 C18色谱柱（4.6 mm i.d.250 mm，5m）；流动相A，90mL乙腈和20mL乙酸用三蒸水定容至1000mL；流动相B，800mL乙腈和20mL乙酸用三蒸水定容至1000mL；柱温为室温；流动相总流速1mL/min；紫外检测器：=278nm；梯度条件：100%流动相A保持10分钟15分钟内由100%流动相A转为68%流动相A，32%流动相B68%流动相A，32%流动相B保持10分钟100%流动相A；进样量：20L。原茶汤，吸附后茶汤，解析后茶汤，没做。不用列出来。咖啡因标准液，茶多酚标准液都在此色谱条件下检测。3 结果与讨论3.1珠状壳聚糖对茶多酚的吸附性能研究3.1.1珠状壳聚糖的用量对吸附率的影响取部分用蒸馏水清洗浸泡至pH为中性的珠状壳聚糖，然后取出用滤纸吸干膜表面水分备用。分别称取0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、4.0g、5.0g、6.0g的珠状壳聚糖于100.0mL干燥的锥形瓶中，分别吸取25.00mL相同浓度的茶汤。置于30的恒温振荡器（180r/min）中振荡2小时。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率情况，茶多酚的吸附率结果如图3-1所示，随着珠状壳聚糖用量的增加，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率呈上升趋势，但当珠状壳聚糖的量达到4g后，茶多酚的吸附率基本达到平衡。在本实验条件下，珠状壳聚糖用量为4.0g。图3-1图中最上面那行文字，删掉。横坐标“投加量”改为“珠状壳聚糖用量” 吸附剂投加量对吸附率的影响3.1.2 温度-时间对吸附率的影响平行取25.00mL质量浓度为1.049mg/mL的茶汤若干份，分别加入等量的珠状壳聚糖，均分成4批，删分别置于20、30、40、50恒温振荡器（180rpm）中，吸附不同时间（0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4.0h、4.5h、5h）后，分别取出测定珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率，结果如图3-2所示。4组的吸附率都随吸附时间的延长逐渐增大，但吸附1.5h后吸附率增加都相对缓慢，当吸附时间2h后，吸附都基本达到平衡，吸附率基本无明显变化，最佳吸附率可达70.96%。随着时间增加在不同温度下，珠状壳聚糖对茶多酚吸附率基本上是增加的，但在吸附时间2.5小时之后增加不明显，这说明了在常温条件下，删珠状壳聚糖对茶多酚的吸附受温度影响很小。而且茶多酚在空气中易被氧化，所以在珠状壳聚糖吸附茶多酚的过程中，温度30 提取2h较佳。图3-2 温度-时间对吸附率的影响3.1.3 茶汤浓度对吸附率的影响称取5g研磨成碎末的茶叶配置出茶汤，分别加蒸馏水稀释稀释删成20%、40%、60%、80%、100%的茶汤，分别测定茶多酚的含量，再准确吸取25mL于锥形瓶中，并分别加入4g壳聚糖，置于30，180r/min的恒温水浴振荡器中吸附2h后取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率情况，茶多酚的吸附率结果如图3-3所示，刚开始，随茶汤溶度的升高，珠状壳聚糖对茶多酚的吸附率逐渐升高，而当茶汤溶度达到60%的时候，珠状壳聚糖对二者的吸附率同时达到最大值，随着茶汤浓度继续升高，珠状壳聚糖对二者的吸附率又开始降低。因此最佳吸附条件的茶汤溶度应为60%。图3-3 茶汤浓度对吸附率的影响这张图最好能再做一条线，用吸附量为纵坐标。不然大家可能有点疑问，为什么吸附率会下降，实际上已经吸附达到平衡，即吸附量是一定的，而茶汤浓度增加，反而显得吸附率下降。3.1.4 pH值对吸附率的影响平行取25.00mL相同浓度的茶汤5份，茶汤pH值为5.38，分别用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至3.0、4.5、6.0、7.5、9.0，然后加入等量珠状壳聚糖，置于30恒温振荡器中（108rpm）吸附4h，测定珠状壳聚糖对在不同pH的茶汤中对茶多酚的吸附率。结果如图所示，在pH=3.00至7.5范围内，随着pH升高，吸附率逐渐增大，说明酸性条件下不利于珠状壳聚糖对茶多酚的吸附；当pH7.5后，吸附率又随着pH增大而减小，这是因为在碱性条件下茶多酚的性质不稳定，最好要有文献标注。容易发生氧化反应，随着溶液碱性的增强，茶多酚的氧化量逐渐增多。因此在本实验条件下，pH=7.5为较佳的提取pH值。图3-4 pH值对吸附率的影响3.2 不同解析条件下对于茶多酚解析率的研究3.2.1 解析次数放在后面。放在解析剂确定好之后。对解析率的影响取25mL 80%的酒精改成“乙醇”。酒精是个混合物。我们用的是分析纯的物质，纯度还是很高的。，加入在最佳吸附条件下吸附过后的珠状壳聚糖，置于30，180r/min的恒温水浴振荡器中解析2h后取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，将解析后珠状壳聚糖用滤纸擦干，再用25mL 80%的酒精在上述条件下解析2h。反复4次。茶多酚的解析率结果如图3-5所示，随着解析次数增加，茶多酚的解析率都有所增加。图3-5 解析次数对解析率的影响3.2.2 解析时间对解析率的影响吸取25mL 80%的酒精，加入在最佳吸附条件下4g吸附后的珠状壳聚糖，置于30，180r/min的恒温水浴振荡器中解析时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，茶多酚的解析率结果如图3-6所示，随时间的增加，二者解析率有所变动，在2h后，二者的解析率基本不变。图3-6 解析时间对解析率的影响3.2.3 解析剂的差异对解析率的影响分别取100%酒精、100%甲醇、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、0.01mol/L EDTA、0.1mol/L EDTA、水25mL。加入在最佳吸附条件下获得吸附后的得到的珠状壳聚糖。置于30，180r/min的恒温水浴振荡器中解析2h。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，茶多酚的解析率结果如图3-7所示，由图3-7显示可知不同的解析剂解析能力不同，其中酒精对茶多酚的解析能力最佳，但不同解析剂对茶多酚的解析量普遍偏小。而EDTA做缓冲液时由于EDTA的溶解度小的原因，易产生沉淀而无法解析珠状壳聚糖中的茶多酚。图3-7 解析剂的差异对解析率的影响3.2.4 解析剂酒精浓度对解析率的影响分别取40%、60%、80%、100%的酒精25mL于100mL干燥的锥形瓶中，加入在最佳吸附条件下吸附过后的珠状壳聚糖，置于30，180r/min的恒温水浴振荡器中解析2h。取出，测珠状壳聚糖对茶多酚的解析率情况，茶多酚的解析率结果如图3-8所示，随着酒精浓度的增加，从珠状壳聚糖中茶多酚的解析率随之增高。图3-8 酒精浓度对解析率的影响3.3 珠状壳聚糖吸附前后茶汤的HPLC对比分析要用哪几张图，跟陈辉商量一下。在写这部分的结果与分析，先要从定性的角度，去分析各个出峰所代表的是什么物质，然后再从定量的角度去分析，EGCG被吸附的量是多少。通过EGCG的标准曲线测定，可知EGCG的保留时间为14.009min 做得EGCG的标准曲线如下图3-9。对图3-10和图3-11进行分析，由数据的原茶汤EGCG 的峰面积33131602；吸附后茶汤EGCG 的峰面积897196。EGCG的吸附率高达97.3%。可以看出珠状壳聚糖对茶多酚具有极强的吸附能力，但对其吸附率十分的小，而珠状壳聚糖对EGCG具有很强的选择性吸附能力。图3-9 EGCG标准曲线图3-10 原茶汤的HPLC图图3-11 吸附后茶汤的HPLC图4 结论由于珠状壳聚糖的表面含有极丰富的-OH、-NH2等功能基团, 可通过与茶多酚形成氢键从而达到吸附茶多酚的目的。实验制备了珠状壳聚糖，用其进行吸附分离茶多酚，实验结果表明，对25.00mL质量浓度为1.050mg/mL的茶汤，较佳的吸附条件为珠状壳聚糖加入量4g、吸附时间为2h、茶汤pH为7.5、温度30时，茶多酚的吸附率可达到80.63 %。珠状壳聚糖对茶多酚具有选择性吸附分离的性质，特别是对茶汤中的EGCG有选择性吸附。由于壳聚糖在自然界中来源是仅次于纤维素的天然高分子材料，且具有无毒性、良好的生物相容性质、生物可降解性能、易成形和加工等优点，使珠状壳聚糖在茶多酚的吸附分离中必将拥有极其美好的应用前景。5 致谢在长达半年多论文实验及论文的撰写过程中，要十分的感激我们的导师薛丽群的谆谆不倦的指导与督促，同时感谢她对我们的谅解与包容。在实验过程中还得到许多其他老师和同学们的帮助和支持，在此向他们表示衷心的感谢！参考文献参考文献太老，都没有2010年之后的文献。要列出几篇出来。1 胥佰涛, 徐平, 沈生荣.茶多酚提取方法研究进展J.茶叶,2007(3):43-46.2 盛 丽,任爱梅.天然抗氧剂茶多酚J.化学教育,2004,11:8.3 FUJIKI H, SUGANUMA M, IMAI K, et al. Green tea: cancer preventive beverage and/or drugJ. Cancer Lett, 2002, 188(1/2): 9-13.4 郭宇姝, 张沂,朱新生.茶多酚的提取分离与含量测定方法进展J.解放军药学学报, 2007, 23 (2):121-124.5 DAVID J M, GUO P L, NAI S C. Cholesterol-lowering effect of a theaflavin-enriched green tea extractJ. Arch Intern Med, 2003,163:1448-1453.6 董文宾,胡英,周玲.有机溶剂法制备茶多酚的工艺研究J.食品工业科技,2002,23(9): 44.7 Kyung H R, Yinzhe J. Recovery of catechin compounds from Kore an tea by solvent extraction J. B ioresource Technology , 2006,97 (5) : 790.8金志凤，封秀燕 基于GIS的浙江省茶树栽培气候区划茶叶,2006（1）：7-109 肖能文湖南省茶树害虫调查和区系分析D湖南农业大学，2002年6月10 曹雁平,李建宇,朱桂清,等.绿茶茶多酚的双频超声浸取研究J.食品科学,2004,25 (10) : 139.11郝春晖，张庶萍GIS支持下的农业信息化问题研究.中国农机化，2005(4)：47-4912 罗志敏, 薛丽群,张婷,等. 珠状壳聚糖树脂对绿茶中茶多酚的吸附研究J.食品科学, 2009, 30(01) : 86-89.13 梁足培,桑明心,李 建,等. 戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制备J. 青岛科技大学学报, 2006, 27(2):123.14 Huang J H, Huang K L, Liu S Q, et al. Adsorption properties of tea polyphenols onto three polymeric adsorbents with amide groupJ. Journal of Colloid and