农业微生物生物技术.doc

一背景农业包括种植业、养殖业、水产业及农产品加工等各个领域，不仅为人类生存、发展提供食物、能源而且还为工业发展提供原材料等。可持续农业是指控制农业病虫害破坏程度、提高作物生命力、保持生物多样性、改良农业环境以及采用新式农具等方面的内容，与生态农业密切相关，其中农业微生物在可持续农业中将发挥愈来愈重要的作用。有些微生物对农业生产有益，如根瘤菌（固氮作用），苏云金芽孢杆菌（微生物杀虫剂它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白(ICPs)，又称-内毒素，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性）等；而有些有害，但二者之间较难区分。例如：茭白，它是一种粮食，被茭白黑粉菌感染后发生黑粉病，植株变短，不能抽穗结实，对以收获为目的的栽培来说是有害的，但这种病变的粗短茭白茎很鲜嫩，可以作为蔬菜食用，因为茭白黑粉菌可分泌一种生长素，刺激茭白细胞膨大。引发水稻恶苗病的赤霉菌感染水稻以后，水稻秧苗又细又长，然后枯萎死去，严重影响水稻的产量，但该病原真菌可产生植物激素赤霉素（具有促进细胞分裂和细胞伸长，促进花芽分化，促进果实与胚生长，促进种子萌发的生理作用），目前采用发酵法生产赤霉素。固定发酵:保藏菌种斜面试管活化液体摇瓶扩大培养固体发酵生产。液体发酵:保藏菌种活化液体发酵二附生微生物根据微生物生长的部位不同，可分为（一）根际微生物土壤组成很复杂，对于微生物来讲属于营养贫乏的环境，其中有机质的含量在0.82.0%，大多数的碳以腐殖酸形式存在，微生物难以利用。植物根际包括跟表面及其周围2mm范围内的区域，在这个区域内，由于根在土壤中生长代谢，向周围释放部分有机质包括氨基酸、单糖、有机酸、根分泌的糖类、酶，根部脱落的细胞或死亡的细胞及根产生的二氧化碳及乙烯等物质。据估计，植物光合作用固定的碳有20%分布在根部，因此根际的环境有利于微生物各种群间的平衡。根际微生物之间发生复杂的相互关系，且与植物本身有密切的联系，可刺激植物的非特异性防御反应，从而提高植物抵抗其他病原微生物的能力，还可向植物提供营养元素等物质。根际微生物类群包括细菌（含放线菌）、真菌（含酵母菌）及原生动物等，多种微生物以微生物生物膜的形式存在于根际，比如根瘤菌属。（二）叶际微生物叶际微生物并不仅限于生活在植物叶片上的微生物，还包括生活在幼芽、花等植物地上部分的微生物。因为叶片上细菌数目占有绝对优势，所以多数研究是从此进行的。叶际微生物群体包括不同种类的细菌、丝状真菌、酵母菌、微藻，有时也发现有原生动物与线虫等。1.叶际微生物对植物的影响（1）叶际微生物可改变植物表面的性质植物表面温度与湿度变化大，且为微生物生长提供的营养极其有限，则叶际微生物可以产生一些具有表面活性剂功能的化合物来增加叶面表皮层的亲水性，使细菌易于向营养丰富的地方游动。假单胞菌具有产生表面活性剂与丁香霉素的能力，大多数叶际细菌可产生吲哚乙酸，影响植物的生长发育。叶际的甲基杆菌属可产生细胞分裂素，刺激植物细胞分裂伸长，并可刺激细胞壁释放出甲醇供细菌利用。已发现在大豆叶部应用甲基杆菌属可提高大豆的产量。（2）叶际微生物的细胞密度变化对叶际微环境的影响细菌在植物叶面以聚集体形式存在，这样有利于细菌在叶际微环境抵抗不良的环境条件，其中的细菌还可产生细胞外多糖，不仅有利于维持聚集体结构，而且可保护细菌免受干旱与活性氧自由基的影响。如丁香假单胞菌在干旱与活性氧刺激下，可提高海藻酸合成量，以减轻不利因素对细胞的影响，同时细菌聚集体中高密度的多糖还可向叶际微生物提供营养，这些细菌聚集体通过产生细菌信号物质N-酰化高丝氨酸内酯来调控不同种类细菌的代谢活动，共同适应其生活环境。（3）病原细菌通过改变叶际微环境而表现出致病性致病性丁香假单胞菌的致病能力与叶际细菌群体数量有关2.叶际微生物在生物技术中的应用（1）苹果火疫病防治菌剂由解淀粉欧文菌引发的，对苹果和梨的危害最大。在致病菌定殖于花之前 ，由非致病菌荧光假单胞菌菌株A506或成团泛菌定殖于植物花部位，就可抑制致病性解淀粉欧文菌对花的定殖与危害。（2）新型病害生防制剂Harpin的开发Harpin是一类能激活、诱导植物保卫反应和产生系统抗性的新型蛋白，最早发现于梨火疫病菌的侵染过程。这类蛋白具有作用机制独特、防病和促进植物生长效果显著和环境友好的优点，将其用于绿色农药。（3）叶瘿的应用藤黄红球菌是一种可在叶际存活的放线菌。自然条件下，主要以附生形式生活在植物表面，通过破坏叶片表层细胞进入植物内部，在植物有伤口时通过伤口进入。它可干扰植物激素平衡形成叶瘿，但是它的维持需要藤黄红球菌菌体的存在，所以将其应用于植物种质的资源保存与快速繁殖（红球菌受到诱导合成细胞分裂素有关）。（4）冰核细菌（INA细菌）的应用冰核细菌是广泛附生于植物表面，在-5条件下具有冰核作用（促进过冷却水结冰冰核活性）的细菌。 作作为报告基因的应用克隆的冰核基因可在非冰核生物体中表达,通过测定冰核活性检测冰核基因的表达,并可根据冰核活性的大小来确定冰核基因表达的强弱。用冰核基因做报告基因有以下优点：冰核的形成是一个物理过程，不需要酶化学反应，扩大了冰核基因做报告基因的应用范围;活性检测所需的设备为低温乙二醇槽，费用低，检测方便快捷，且效率高，一般只需3min；其检测灵敏度同荧光素酶相当；在6个数量级的范围内，冰核数量与冰核基因产物的剂量间成对数线性关系，因此可用冰核活性强弱来定性定量测量检测基因的表达量。 在防霜方面的应用从自然界植物体上的多种微生物中筛选对INA细菌有拮抗作用、营养竞争能力强、抑杀或寄生性强的微生物菌株，对其进行人工生产繁殖后，再喷洒在植物体上，以其控制或杀灭INA细菌，达到防御霜冻的目的。通过转座子Tn5诱变重组后筛选获得的菌株，其插入位点在冰核基因中间，使冰核基因的线性连续性受到破坏，丧失冰核活性，而其他基因的连续性和完整性均未受到影响。因此，突变菌株的营养特性和定殖能力等生物学性状并未发生改变，从而对原野生冰核细菌产生更强的营养竞争和位点竞争作用，可大大减少植物上冰核细菌的数量，降低发生霜冻害的温度，达到减轻和控制霜冻害的目的。 防御冻害方面的应用（防冻剂）许多植物能够耐受细胞间结冰，但一旦细胞内结冰就发生冻害。如一些高山植物能产生冰核，使胞间水在冰点附近发生结冰，把胞内水吸到细胞间以防止胞内结冰。把细菌冰核基因导入植物，它有效表达后会产生生物冰核，可大大提高胞间水结冰的温度，增强抗寒力。 构建促冻杀虫基因工程菌降低越冬害虫数是有效控制虫害的可行方法。构建促冻杀虫基因工程菌Enc18liceh和Enc2022ice可显著提高害虫的过冷却点，并可在害虫肠道有效定殖，其低温冻杀效果明显。 病原微生物检测方面的应用将冰核基因整合到对沙门菌具特异性的噬菌体中，然后改造后的噬菌体加到待测的食品或者水源样品中，经培养后检测冰核活性。这种方法可检测到107个杂菌中含有10个沙门氏菌或1mL水中含10个沙门菌，该方法具有检测快捷，灵敏的特点。 食品工业的应用将冰核活性基因inaE与由半乳糖诱导的启动子GAL1相连，转入酿酒酵母中应用于食品冷冻工业，可将冷冻温度由-13提高到-6 我国也已掌握了利用冰核细菌制备人工降雪催化剂技术，已完成产品的中试，进入应用阶段。三植物内生菌有些微生物可以生活在植物组织内部，这些微生物不引发植物产生明显的病症，对植物的生长发育表现出有益的效应，包括细菌（含放线菌）、真菌等多种微生物。对内生微生物的分离研究需通过表面消毒程序消除附生微生物对内生微生物分离的影响。（一）植物内生菌在生物技术研究中的应用植物内生菌可增加植物抵抗病原菌感染的能力，因为其定居在植物组织内部，避免同根际、叶际微生物之间的竞争，还可防止原生动物对微生物细胞的捕食。1.预先向棉花中接种植物内生菌可提高植株抗黄萎病的能力，并且可以检测到其在维管束运动；2.作为基因工程表达菌株还可在植物组织中表达目的产物，从而达到植物基因工程的效果。3.内生菌产生的代谢物可影响到植物细胞，而植物的次级代谢产物也可对微生物的代谢活动造成影响。如金黄色葡萄球菌的NorA为外排泵蛋白，可将黄连素（小檗nie碱）从细胞内排到细胞外，而黄连素是一种生物碱，推测小檗属植物还可能产生抑制NorA外排泵外排黄连素的物质，这样保持植物与微生物之间的平衡。通过定向筛选发现这种物质为治疗麻风病的传统药物晁模油（为两性弱酸）的次要组分。（二）根癌土壤杆菌在植物生物技术中的应用获得转基因植物的关键是将克隆的遗传物质有效地导入植物细胞核中，并使其整合到植物染色体中，但植物细胞壁十分坚固，通常DNA不能通过。去除植物细胞壁后，外源基因可导入植物细胞，但由于植物细胞中不存在任何质粒DNA，所以外源基因难于在植物细胞中复制下去，这是植物基因工程的一个难题。而植物病原菌根癌土壤杆菌可将部分质粒DNA导入植物细胞，并将其插入到植物染色体组中，所以采用根癌土壤杆菌将目的基因转入植物可有效的解决植物基因工程中的关键技术难题，利用这种方法已获得具备抗除草剂、抗虫、抗病毒等特性的植物品种。四菌根菌物与植物之间是一种互惠共存关系，在工业荒地、露天矿等地区的土壤含有强酸和有毒金属，把相应的菌根菌引进这种土壤，不但能协助植物幼苗吸收土壤中的养料，而且可保护幼苗免受土壤中有毒物质的危害。在新的荒山植树造林，如与菌根菌同时播种，可明显提高造林成活率。根据菌物的菌丝体和与之共生的植物在根部所形成的特有形态结构，它们之间的营养交换关系以及菌根的类型，可分为以下几类：（一）外生菌根特征是菌根菌的菌丝在植物根部外围形成菌丝套，菌丝一般不进入植物细胞内部，只分布于植物细胞间隙，所以从植物获取的营养较少，对植物影响不大。包括：1菌套：根部外表面菌丝相互交错形成，可保护根尖免受机械损害（根尖附近有根端分泌物促进菌丝生长），其厚度与土壤湿度有关，在湿河滩地，菌套较薄，而生长在高山阳坡的菌套较厚，起到吸收和保存营养的功能。2外延菌丝：多数菌套有外延菌丝伸出，呈放射状或交织成网状3哈氏网:细胞间隙之间的菌丝体相互连接呈网状，这一现象由德国植物病理学家哈蒂发现，所以称为哈氏网。其具有生理活性，这些菌丝也会影响到根部皮层细胞的生命活动。（二）内生菌根也称泡囊丛枝菌根（VA菌根），90%以上的植物的根部或假根部都有。包括：1.泡囊：生菌根菌丝顶端结构，调节营养交换和贮存营养的器官2.丛枝：产生于根部皮层细胞内，扩大了菌根菌与根部细胞质之间的接触和交换面积3.外生菌丝：生长在根部外，是吸收根外水分和营养的器官4.内生菌丝：生长在根部皮层5.孢子和孢子果：孢子是在寄主体外的土壤中形成的，孢子过泛指着生孢子的器官或指产生孢子的子实体（三）兰科植物菌根根的表面不形成菌套，菌丝集中在细胞质中，多呈螺旋状或弹簧状，成为胞内菌丝螺旋团，皮层中无哈氏网。（四）杜鹃石楠型菌根菌根菌较VA少，主要与石楠目的植物结成菌根关系。不形成菌套，未发现哈氏网，细胞质中的菌丝与根表面的外生菌丝相连。五微生物农药（一）来源于微生物的具有农药活性的物质，包括活体微生物和微生物产生的代谢物等。所以分为：1.活体微生物农药：将有害生物致病的病原微生物活体直接作为农药，可通过工业的方法大量繁殖，加工成制剂后作为农药产品使用，所以存在储存困难、不易管理的缺点。2.农用抗生素：由细菌（含放线菌）、真菌等微生物在发酵过程中所产生的次级代谢产物，其具有抑制有害生物的作用，通常按防治对象分为杀虫农用抗生素、杀菌农用抗生素、除草农用抗生素、植物生长调节农用抗生素等。虽然微生物农药相较于化学农药存在稳定性差的缺点，但其来源于自然环境，具有如下优点：1.选择性强；2.对人畜等生物比较安全，环境相容性高；3.通常对天敌比较安全；4.不易产生抗性5.生产工艺简单6.开发与登记等费用低所以称为当今农药开发热点（二）微生物杀虫剂1.用于防治害虫的微生物必须具备：（1） 强致病性，将虫口密度控制在经济损失允许的水平以下；（2） 易于生长，并可长期保存；（3） 具有迅速的杀虫效果或传播感染能力；（4） 残效期长，使用后在较长时间内保持杀虫活力；（5） 成本低，对人畜安全，对植物不产生药害等2.细菌杀虫剂（1）苏云金芽孢杆菌杀虫剂苏云金芽孢杆菌杀死宿主昆虫主要靠其芽孢和毒素。在敏感昆虫吞食苏云金芽孢杆菌的芽孢后，芽孢在昆虫肠道内迅速萌发并增殖，引起肠道麻痹，最后穿透肠壁进入血液，引起昆虫败血症而中毒死亡。苏云金芽孢杆菌可产生对昆虫有致病性的杀虫毒素，按照杀虫毒素存在的部位可分为内毒素和外毒素两大类：外毒素是菌体生长过程中分泌到胞外的代谢产物；内毒素也称晶体毒素，以蛋白质晶体结构的形式存在于细胞中，随芽孢释放到胞外，是主要的杀虫毒素。其杀虫毒素可分为-外毒素、-外毒素，-内毒素、-外毒素和双效菌素,其中-内毒素(即伴孢晶体毒素,ICPs)(2)遗传重组苏云金芽孢杆菌利用DNA重组技术对毒素基因进行改造,构建综合性能优良的重组菌株并发展遗传重组杀虫剂 转移质粒(修饰和交换)拓宽苏云金芽孢杆菌的杀虫谱(细胞水平重组菌) 改造ICP基因结构,提高晶体蛋白毒性苏云金芽孢杆菌毒素蛋白有决定宿主范围和杀虫活性的两个不同的功能区，不同苏云金芽孢杆菌之间决定宿主范围的功能区氨基酸序列差别较大，但决定杀虫活性的功能区氨基酸序列几乎相同，所以采用遗传工程将不同亚种的毒素蛋白基因拼接成杂合基因以扩大杀虫范围或对原有的毒素蛋白基因进行重组以提高杀虫效果。 消除菌株部分多余质粒，提高ICP基因表达量减轻菌株代谢负担，提高菌株的毒力 增加ICP基因拷贝数，提高ICP基因表达量这是有效策略，但不能过高，会对受体菌产生负效应 利用辅助蛋白的增效作用，提高ICP基因表达量（3）假单胞菌铜绿假单胞菌致病能力与产生的蛋白酶（有毒的胞外酶）有关，进入血腔后，致病能力增强3.真菌杀虫剂通常真菌感染虫体后，先分泌毒素杀死寄主，然后在寄主的尸体上生长发育，最终使虫尸充满菌丝而僵硬。利用其防治虫害，可以通过人工培养大量收获真菌菌体或分生孢子，将其制成杀虫剂，进行大面积喷洒。可以采用固体发酵法或液体深层发酵法生产真菌杀虫剂，所以真菌菌体和分生孢子很容易得到如：白僵菌（感染致死昆虫表面有一层白色菌丝，上部呈粉状即白僵菌的分生孢子，用来防止松毛虫、玉米螟和水稻叶蝉等害虫）绿僵菌（用来防治地下害虫、天牛、蝗虫、蚊虫及玉米螟等）对其也可进行遗传改良4.病毒杀虫剂将患病的昆虫释放到林中，渗入害虫群体，随流行病的蔓延，虫口密度明显下降。具有宿主特异性强，可在害虫群体内流行，持效作用时间长等优点；但病毒制剂的生产过程需大量饲养昆虫，成本较高，同时施用效果受外界环境影响大，不稳定且宿主范围窄，使用次数较多。核型多角体病毒在森林害虫的防治中，显出独特的持久效果提高病毒杀虫效果的措施：（1） 插入昆虫自身存在和产生激素或酶的基因以提高杀虫速度激素或酶的基因在昆虫体内过量表达，从而干扰昆虫正常的生理反应，达到使昆虫减少或停止取食和加快死亡的目的（2） 插入外源毒素基因以提高杀虫速度（3） 改变核型多角体病毒非必需基因增强杀虫效果（4） 病毒增效蛋白（5） 化学诱变获得独立提高的病毒株系，但现在研究较少生产主要采用活体昆虫增殖（三）微生物杀菌剂：不同微生物种群间关系1.芽孢杆菌：对植物病原真菌有较强的拮抗作用枯草芽孢杆菌开发的菌剂不仅可以防止水稻稻瘟病等真菌病害2.假单胞菌：可产生铁载体及抗生素等抗菌物质，常用于控制植物真菌病害与细菌病害。如洋葱假单胞菌可防止柑橘腐烂（指状青霉）3.微生物杀菌剂的改进：生防试剂主要以野生型微生物为基础，其自身种群的繁殖及作用效果易受到环境等诸多因素的影响，防治效果不稳定，适用范围狭窄，地理适应性较低；且生产、储存又要求较严格的条件；同时在防治过程中有滞后效应，地理适应性较低，对控制那些突发性病害或流行速率很快的病害还有困难。（1） 解决生防微生物活细胞制剂的大量发酵生产，制剂的长期有效保存和应用的技术问题（2） 使生防微生物能够在靶标病原菌侵入之前，就定殖于寄主植物表面并在作用位点快速增殖（3） 开发其代谢产物，利用基因工程、酶工程、发酵工程、细胞工程生产生防微生物的代谢物产品，研制新的生物制剂（4） 利用现代分子生物学的方法对直接从自然界获得的生物防治菌进行遗传改造，以提高生防微生物竞争存活能力和病害控制效率（四）微生物除草剂根据某些杂草病原菌的宿主特异性，如炭疽病菌，它仅寄生在菟丝子上，可用来防止菟丝子（使受害植株生长不良，也有寄主因营养不良加上菟丝子缠绕引起全株死亡）。（五）农用抗生素按用途分为：1. 杀虫农用抗生素阿维菌素通过昆虫表皮及胃肠道，具有杀虫、杀螨及杀线虫活性的大环内酯类抗生素2. 杀菌农用抗生素井冈霉素通过抑制立枯丝核菌的海藻糖酶而达到抑菌效果，对水稻纹枯病有特效，成功取代对人畜和环境有害的有机砷农药。（海藻糖是立枯丝核菌储存糖类必需的物质，海藻糖酶可消化海藻糖，将葡萄糖运送到菌丝体顶端，井冈霉素可使菌丝体顶端产生异常分枝而停止生长，并无杀菌活性）3. 除草和植物生长调节农用抗生素赤霉素是具有植物生长调节农用抗生素双丙胺膦微生物除草剂，可以植物体内谷氨酰胺的合成导致氨积累，从而抑制光合作用中的光合磷酸化，导致植物死亡。可用于防治狗尾草、马齿苋等。（六）真菌病毒已发现病毒或dsRNA对真菌有以下影响：1. 引发蘑菇病毒病害2. 减弱病原真菌的毒力3. 引起寄主细胞的裂解4. 使寄主杀死同种真菌六微生物肥料具有改善植物氮、磷、钾及微量元素营养，促进植物生长能力的生物制剂的总称。筛选，获得高效菌株，扩大培养，制成微生物制剂回到土壤中（一） 固氮微生物肥料1. 豆科植物的共生固氮根瘤菌2. 非豆科植物的共生固氮弗兰克菌可遇木本双子叶植物共生结瘤孤单，这类植物称为放线菌结瘤植物3. 蓝细菌和植物的共生固氮蓝细菌与蕨类植物的共生体绿萍（又