葡聚糖凝胶层析.pdf

第 2 2卷 19 9 4 芷 第 4期 1 2月 河南职技 师院学报 J o ur n a l o I He n a n Vo c a t i o n Te c h n i c a l Te a c h e r s Co l l e g e VO 1 2 2 N0 4 De c 1 9 9 4 葡聚糖凝胶层析 蛋 白质脱盐 7 实验的技术改进 L 卫 堕 刘荷芬 汤菊香 塑盍叠 一 一 农学系 新乡 4 5 3 0 0 3 濮阳县农牧局 Q f 摘要葡聚糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的实验中 对常规实验方法中的装柱技术 洗脱速度作 了部分 改进 在 用 6 8 0 n m 波 长 比色 时 发现 一十 与血 红 蛋 白峰平行 的 未知 峰 通 过大 量 实验 验 证 得知未 知峰 是 由于血 红 蛋 白在 6 8 O h m 波 长有较 小 的吸收值 而 呈现 的 关 翻 些舳峰 聚糖 擘 r Th e A 类 号Q7 8 3 J 葡聚糖凝胶 S e p h a d e x 层析 实验 是我 院近几年 新开设 的生化 实验 我 们在 预试 工作 中 依据北京大学生物系编 生物化学实验指导 为基础 对实验方法进行 了部分改动 在测光密度 值 时 用 6 8 0 n m 波长测定硫酸铜 的吸收光谱 此外 在多 次重 复实验过程 中 还摸索 出了一套 手持装柱 技术 边 装柱 边振 荡 装 出的柱 床均 匀无节 无气泡 并适当增加 了柱 床高度 对提高 层析 效率有 一定 的作用 同时对 加样 技 术 洗 脱速 度也进行 了改进 在 加样时 采用 加皮头移液管 轻触 床面 加样 法 样 品能均匀扩散 又 不致冲坏床面 对提高 层析 效率 也起 了一定作用 在平衡洗脱时 常规实验 指导 书都 是用 0 5 ml mi n的洗脱速度 经过 多次的实验 认 为洗脱速 度控 制在 0 7 l mL mi n为好 现 将实验 技术 与结 果报 道如下 1 实验技术 1 1 实验 材料 葡聚糖凝胶G一 2 5型 粒度 1 O 0 3 0 0 血红 蛋 白质溶 液与硫酸铜盐溶液按 1 1混合为样 品 蒸馏水为洗脱液 血红 蛋 白溶液 的制 备 取抗凝鲜血 1 0 ml 用五倍以上体积的 0 9 氯化钠溶液洗涤四次 每次用 2 0 0 0 r min速度 离 心 5 mi n 去 上清液 最后用 3 0 0 0 r mi n的速 度离 心 l O mi n 去上 清液 于洗 净 的红 细胞 中加 等体 积 的蒸馏 水和 0 5 ml 四氯化 碳剧 烈振 荡 使血 球全部 溶血 用皮 头滴管 吸 出上 层的红色 透 明液 即为血 红蛋 白溶液 收 稿 日期 1 9 9 4 0 6 2 1 27 维普资讯 硫酸 铜盐 溶液 称取 3 7 3 g Cu S O 溶 于 1 o ral 热 蒸 馏 水 中 冷后 稀 释 到 1 5 ml 再 称 柠 檬 酸 钠 1 7 3 g Na C O H O1 窟 加水 6 0 m1 热溶解后冷 却 稀释至 8 5 ml 把 Cu S O 溶 液倒 入柠檬酸 钠一 碳酸 钠溶 液中 混匀 即为硫酸铜溶液 1 2 操作方法 1 2 1 凝胶的处理称取 5 g S e p h a d e x G 2 5 干胶 加到约 5 o ral 蒸馏水中 在室温下溶胀 6 h 或用沸水加热 溶胀 2 h即 可 然后甩浮选法 除去小颗 粒和碎片 1 2 2 装 柱本 实验选 用 l c m 4 0 m 的层析柱 洗净 后 用手握住 从上 口加入洗 脱液 排除 死体积 内的气泡 留洗脱液 3 4 ml 然后将 1 体 积湿胶 0 5体积洗脱液混成匀浆 沿 管壁慢慢 加入柱内 再将柱垂直固定在铁架台上 用少量洗脱液冲洗管壁 稳定下沉 l O min 柱高一般在 30 35 c m 1 2 3 平衡调 节恒 流泵 选择 0 7 l ml mi n的流速 以 2倍 床体 积 的洗 脱液 进行平衡洗 脱 1 2 4 加样切断恒流泵 打 开柱底 出 口 放洗脱液 至胶床面 齐 关 闭下 口 取 5 mL样品 使 移液管尖端慢慢 地接 触到 床面 轻轻挤压皮头 使样 品放入床内 再用 l ml 的l洗脱液 冲洗管 壁 2次 最后加洗脱液约 5 8 m1 1 2 5 洗脱 与收 集接 上恒流 泵 仍 以 0 7 l ml mi n的流速进行 洗脱 收 完样品 一般 在 l 5 管左右 每管收集 ml 1 2 6 比色每管加水 l ml 稀释 1 倍 用 7 2 1 分光光度计测光密度值 每管都测二个波长 渡长分别为 5 2 0 n m 和 6 8 0 n m 1 3实验 结果 一 根据 5 2 0 n m和 I5 8 0 n m波长测定的光密度值 分别以管数为横坐标 以光密值为纵坐标进 行绘图 其 结果 如图 1 2 未知 峰的发现与验证 在 实验 中 当用 6 8 O h m 渡长 比色 时 测得 的 光 密度有 两个 峰 而且前 一个峰 总是 位于血红 蛋 白峰 的下 面 与血 红 蛋 白成 平行 状 态 如 图 l所 示 针 对这个未 知 峰的 出现 我 们从 三方面 进行 了分析 和验证 第一 此峰可能是分离不 佳 红色溶液 中仍有 铜 盐存在 盼缘故 第二 也可能 此峰是血 红蛋 白在 6 8 O h m 处有 吸收 一 图 1 洗脱曲线 1 血红蛋自在5 2 O h m处 暇 峰 2 硫酸铜盐柱 6 8 0 Il m处的硬收峰 3 未知 峰 敦 根据这种猜测 我们首先用化学的方法对层析出来的红色溶液进行验证 取待测的红色溶 液 2 ml 加 0 0 1浓度 的葡 萄糖 2 ml 在 沸水洛 中加 热 5 mi n 如 有铜 盐存 在时 就有黄红 色沉淀 生成 C u O 但结果没有这种现象发 生 这样就排除了红色溶液中有铜盐的存在 接着我 们 2 8 维普资讯 用 7 2 1 型分光光度计作了血红蛋白的吸收光谱 结果是 血红蛋白在 5 2 0 n m处的吸收值为 1 2 在 6 8 0 n m 处的 吸收 值 为 0 1 这样未知峰 的问题就查清 了 只不过 是血红 蛋白在 6 8 0 n m 处 吸收 弱些罢 了 所以 当用 6 8 0 n m 比色 C u S O 时 3 6管 内围血红 蛋 白存在而 出现 一个 小于 5 2 0 n m 吸收峰的小峰 即所谓的未知峰 3 提 高层 析 率 的讨论 3 1 柱 长与层析 效率 提高 层析效 率 也就是 提高被 分 离物质 的分 离度 而分离度与柱床高度有着密切的关系 首先 从层析谱上看 如图 2所示 这是两 种被分离物从 层析柱上洗脱 下来 的正 态分布 曲线 V 代表第一 种物 质从加 样开 始到峰顶 出现 所用 的洗 脱体积 V 为第二种物质从加掸开始到峰顶 出现时的桄 图 2 层析谱 脱体积 Y Y 分别代表两峰峰底的宽度 8为标 准差 表示各组分 的分散 度 s值大 t 峰宽不利 于分 离 a 值 小 峰窄 易分离 分离度 R 表示相邻两峰 顶距 离是 两峰 平均 宽度 的几倍 它是衡 量被分离物分 离好坏 的重要 标志 其表示方法有两种 c 当 时 l广 2 R 一 二 土 式 一 等 一 鲁 1 一柱长 h 一理论塔扳高度 N 有效理论塔板数 从 R 看 增大 V e 一V e R变大 相邻 两峰易分离 井日 反 减少 V e 一V e 则 R变 小 峰易重遗 层析效率低 l厂 依 公 式 R 1 吉 当 a 不 变 时 增 大 l R 变 太 相 对 层 析 谱 来 说 也 就 是 增 大 了 ve 一ve 因此 在层析时 增加柱长 则有利手峰的公离 能提高层析教率 但也 不能无限地 增加桂长 因为柱过长 层析时间长 样品易扩散 增大 了 值 形成胖峰 影响分薄效柒 故在 低于 2 0 e m范围内增加柱长 有利于提高层析效率 在实验中 就柱床高度与层析效率进行了大量的测定 原实验要求层隹垂直固 定碑铁架 上 一次性装柱 柱床高度只能达到 2 0 厘米左右 在此柱上分离得到的效果不好 被分离物不 易分开 图 3 在 不影响凝胶床均 匀 无气 泡 无纹路的前提下 我们采用手持层析 柱装 柱法 来增加柱床 高度 其方法是 左手 握层 析柱 稍顷斜 右手持盛有凝胶的烧杯 从 上 回沿 管壁加入凝胶 边加 凝胶边 振动柱床 使 凝胶不 易迅速 固定 凝胶装 完后 迅速将柱 垂直 固定在铁 架上 关闭下 口 使 胶下沉稳定 用这种方法装柱 柱 床高度 比原来增加 5 0 左 右 柱床 无节痕 无 气泡 分离效 29 维普资讯 果较好 图 4 3 2 加样与层析效率 原实验要 求用吸管吸取 0 5 m 样品加到床面上 但 阳此法 加榉 易冲坏 床面 造 成 区带 参 差不齐 影响 分离 效果 为此 进行 了加样方 法的改进 用皮头 移液管 加样 容易控制 加样 速度 一般 不 破坏床 面 样 品能均 匀地 扩 散 区带整齐 得 到的分离效果较好 另外 我 们还 对 样品浓度 和用 量进 行 j 试 验 其 结 果 是 样 品过 浓 量过 大 其 粘 度大 相 互牯 合 不 易分 离 但 样 品过 稀 量过 少 时 由于分子 扩散 作 用 也得 不 到好的分 离效果 3 3 流速与层析效率 原 实 验 要求 0 5 ml mi n的洗 脱 速 度 层析 柱 加 长 暗 经过 实验 发 现用 0 5 ml mi n速度样 品 在柱 内易扩 散 洗脱时 间长 而且洗脱峰 出现拖尾现象 影 响分 离效 果 实验结桌用 0 7 l mL m i n的洗脱速度 既缩短了时 间 也得到了较 好的分离效果 根据这种 实验结果 我们 认为洗 脱速度 应 缒着 柱 床高度 而变 化 柱床长 洗脱 速 度 应适 当增 大 这 样 可 以加 速分 子 在 孔 隙 内的 移动速 度 防 卜 扩 散作用 柱床 短 洗 脱速度 应相 应减 小 以使 分子 量不同的物质 在凝 胶柱 内达 到很 好的 分离 为度 参考文献 圉 3 柱床 2 2 c m 的层析谱 圉 4 柱床 3 4 5 c m 的层析 谱 J E 京大 学生 物系 生 物 化学 实验 指导 北京 高等教 育出版 社 1 9 8 5 2 3 5 2 4 0 张龙 翔等编 生化实验 方 法和 技术 北京 民教育 出版 社 1 9 8 2 1 2 4 1 3 2 朱倚等 生物他学实验 上博科学技术出版社 I 9 8 1 9 1 1 1 6 p 丁普 声默 实用生 物 化学 导论 吴学