胶原纤维负载金属离子固定酵母细胞及其发酵特性研究.doc

胶原纤维负载金属离子固定酵母细胞及其发酵特性研究*何利 何强 廖学品* 石碧*（四川大学制革清洁技术国家工程实验室，四川，成都，610065）摘要：以皮胶原纤维为基质，制备了胶原纤维负载Zr()（ZICF）和胶原纤维负载Fe()（FICF）细胞固载材料。以酵母为模型细胞，研究了固载材料对细胞的吸附固定及其固定细胞的发酵性能。研究发现，当酵母初始浓度为3.6105 cfu/mL，在pH 6.0和30条件下，ZICF和FICF对酵母细胞的固定量分别为6.68107 cfu/g和5.44107 cfu/g。pH值对酵母细胞在ZICF上的固定量影响不明显，处于稳定期的酵母细胞在ZICF上的固定量最大，NaCl浓度为0.1 mol/L时最有利于酵母细胞的固定。ZICF对酵母细胞的吸附平衡符合Freundlich方程，其吸附动力学可采用拟二级速率方程描述。固定在ZICF上的酵母细胞能保持良好的生物活性，表现出较高的乙醇发酵能力。在含15%葡萄糖的乙醇发酵培养基中，固定化酵母细胞的乙醇产量可达9.1%(v/v)。ZICF固定的酵母细胞可以多次重复使用，在第12个发酵周期内，其乙醇产量仍达到7.8%(v/v)。关键词：胶原纤维；金属离子；酵母细胞；固定化载体；乙醇发酵中图分类号：TS261.1 文献标识码：A 文章编号：Immobilization of S. cerevisiae cell on metal ion-loaded collagen fiber and its ethanol-fermentation propertyHe Li, He Qiang, Liao Xue-pin*, Shi Bi 基金项目：国家自然科学基金项目(20536030) ; 国家科技支撑计划(2006BAC02A09).作者简介：何利(1984), 女,重庆璧山县人, 博士研究生通讯作者：石碧. E-mail: ; 廖学品. E-mail: .(National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Manufacture, Sichuan University, Chengdu 610065, P.R. China)Abstract: Two novel cell immobilization supports, Zr()- and Fe()-loaded collagen fibers (ZICF, FICF), were prepared by loading Zr() and Fe() on collagen fiber. As an experimental model, the immobilization behaviors of Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) cells on ZICF and FICF were characterized, and consequently, the fermentation activity of the immobilized cells were investigated. The amount of cells immobilized on ZICF and FICF reached 6.68107 and 5.44107cfu/g, respectively, when the immobilizing reaction was carried out by using 3.6105 cfu/mL of S. cerevisiae cells at pH 6.0 and 30. Environmental pH did not show substantial effect on the immobilization of S. cerevisiae on ZICF. A maximal immobilization amount was achieved in 0.1 mol/L of NaCl solution by using the cells growing at stability phase. The immobilization (adsorption) equilibrium of ZICF to S. cerevisiae cells can be described by Freundlich model, while the kinetic process follows pseudo-second-order rate model. The immobilized S. cerevisiae cells on ZICF exhibited high ethanol productivity, yielding 9.1% (v/v) of ethanol in ethanol-fermentation culture medium containing 15% of glucose. In addition, the ethanol yield kept at 7.8% (v/v) even at 12th fermentation cycle, showing an excellent reusability of the immobilized S. cerevisiae cells.Key words: collegan fiber; metal ion; S. cerevisiae cell; immobilization support; ethanol-fermentation.引 言细胞固定技术在发酵、生物传感器、水处理等领域具有重要的应用价值。而其固载材料对细胞的固载量、细胞生理生化活性、固载稳定性等具有重要的影响。在本研究中，我们以皮胶原纤维为基质，利用其与金属离子的反应活性，制备了胶原纤维负载金属离子细胞固载材料。作为典型的应用实验，以这类新型材料为载体，系统研究了其对酵母细胞的固定化过程以及固定化酵母的乙醇发酵特性。使用游离酵母发酵生产乙醇，由于酵母细胞易流失，同时由于分离困难，产品质量会受到较大影响。为了解决这一难题，目前固定化技术越来越广泛地被应用于乙醇发酵生产中1-4。固定化后的酵母细胞不仅可以多次使用，优化工艺流程，实现连续生产。同时研究表明，采用合理的固定化技术，固定化酵母能表现出比游离酵母更稳定的细胞活性和更高的乙醇发酵能力5。常用的固载酵母细胞的天然高分子载体有卡拉胶、明胶、琼脂、甲壳素、壳聚糖、海藻酸钠和木质纤维素等6-8。与合成有机高分子材料相比，它们具有安全无毒、固定条件温和等优点，但厌氧条件下易被微生物分解，使用寿命短。胶原纤维是一种天然高分子材料，具有很好的生物相容性。胶原纤维含丰富的COOH、NH2、OH等活性基团，能与多种金属离子发生络合反应9，从而可以赋予其优良的细胞吸附能力。而这种反应也同时使胶原纤维成为耐微生物降解、机械性能优良、传质效果好的纤维状材料10。因此，本研究是利用皮胶原这一生物质材料，制备具有良好综合性能的细胞固载材料的一次有意义的探索。1 材料与方法1.1 试剂与仪器试剂 液体麦芽汁培养基，上海晶纯试剂有限公司；在液体麦芽汁培养基中加入2琼脂，115121灭菌25 min，即得固体麦芽汁培养基。乙醇发酵培养基11：葡萄糖15.0%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，MgSO47H2O 0.1%，KH2PO4 0.1%，CaCl2 0.1%，FeSO47H2O 0.001%，K2S2O5 400mg/L, pH 4.0。葡萄糖、酵母膏和蛋白胨，北京奥博星生物技术责任有限公司。琼脂粉，天津市科密欧化学试剂开发中心。其他化学试剂均为分析纯。仪器 扫描电镜（SEM），日本日立公司S-450；恒温空气振荡器，上海福玛实验设备有限公司；气相色谱仪，美国Thermo Electron Corporation, PE900；滤膜，美国Millipore公司(0.45 m)。1.1.1胶原纤维负载金属离子吸附材料制备以牛皮为原料，按常规方法经清洗、碱处理、剖皮、脱碱、脱水、干燥、研磨等过程获得胶原纤维12。将15 g胶原纤维分别放入300 mL 0.05 mol Fe2(SO4)3溶液和0.1 mol Zr(SO4)2溶液中（去离子水配制，pH 2.0)。充分反应4 h后调节溶液的pH至4.0，再于40反应4 h。反应物经去离子水洗涤后，于50真空干燥12 h，得到负载Fe胶原纤维吸附材料（FICF）和负载Zr胶原纤维吸附材料(ZICF），作为酵母细胞固定化载体。1.1.2 菌悬液制备酿酒酵母（S. cerevisiae）由四川大学生态食品与生物技术实验室提供，于液体麦芽汁培养基中增殖培养。28温度下培养48 h后，经离心处理和无菌水清洗，收集细胞放入含生理盐水的锥形瓶中，振荡使细胞分散，获得酵母细胞菌悬液，立即用于吸附固定。1.2 负载金属离子胶原纤维(FICF、ZICF)对酵母细胞的吸附固定将分别称取0.5 g负载金属离子胶原纤维及FICF、ZICF放入无菌水中浸泡12 h，过滤后加入到100 mL一定浓度的酵母细胞菌悬液中（pH6.0，NaCl浓度0.1 mol/L），在30下振荡吸附5 h。同时，以相同起始浓度未加FICF和ZICF的无菌水载体的酵母细胞菌悬液进行空白试验。根据菌悬液中菌体数量的变化，由下列公式计算胶原纤维、FICF和ZICF对酵母细胞的固定量： (1)式中，为空白样中酵母浓度，为吸附处理后酵母浓度（cfu/mL）；为菌悬液体积（mL）；为FICF或ZICF的质量（g）。同时，研究了酵母细胞初始浓度、菌龄、溶液pH值和离子强度等对ZICF吸附固定酵母细胞的影响，并研究了吸附固定过程的热力学和动力学特性。1.3 固定化酵母发酵产乙醇将1 g固定化细胞（载体ZICF，酵母固载量6.68107 cfu/g）加入到300 mL乙醇发酵培养基中，于28振荡培养，以5天为一个发酵周期，用气相色谱分析发酵液中乙醇的含量。同时，使用1 mL对应培养期的游离细胞液（细胞浓度6.17107 cfu/mL）进行发酵对比试验。为了研究固定化酵母的重复使用性，在一个发酵周期结束后用无菌滤膜过滤，回收固定化酵母细胞，经无菌水反复冲洗无酵母细胞检出后，用于下一周期的发酵试验。用扫描电镜（SEM）观测不同发酵周期固定化酵母细胞的形态特征。1.4 分析方法将细胞液稀释成一系列不同浓度的菌悬液，基于平板计数法13测定其细胞浓度。使用扫描电镜（SEM）观测载体及其固定酵母细胞后的微观形态。乙醇发酵实验中，取一定量发酵液蒸馏，稀释馏出液，以正丙醇为内标，用气相色谱分析发酵液中的乙醇含量14。2 结果与讨论2.1 负载金属离子胶原纤维(FICF、ZICF)对酵母细胞的吸附固定试验表明，胶原纤维本身对酵母细胞没有固定作用，但当负载金属离子铁或锆后，对酵母细胞均表现了良好的吸附固定能力。在初步试验中，我们研究了酵母细胞初始浓度对固定量及其乙醇发酵能力的影响。发现当酵母细胞的初始浓度较高（107 cfu/mL）时，其在FICF和ZICF上的固定量也较高（达到109-10 cfu/g），固定能力与文献报道的脱木质素纤维、谷物壳、果皮等相当15-19，但将用于乙醇发酵试验时，发酵液中残糖量高、乙醇产量低；当酵母细胞的初始浓度较低（103cfu/mL）时，固定量也较低（106cfu/g），用于乙醇发酵试验时，发酵液中残糖量低，但乙醇产量也低。而当酵母细胞的初始浓度为105cfu/mL时，载体固定量为107 cfu/g，其用于乙醇发酵时残糖量及乙醇产量情况均较优。因此本文选择酵母细胞初始浓度为105cfu/mL时制备的固定化细胞进行后续研究。当酵母细胞初始浓度为3.6105 cfu/mL，在pH 6.0和30条件下振荡吸附5 h后，FICF和ZICF对酵母细胞的吸附固定量分别为5.44107cfu/g和6.68107cfu/g，ZICF固定酵母细胞前后的SEM观测结果如图1所示，可以发现酵母细胞被吸附固定在ZICF表面。这种固定作用可能源于胶原纤维负载金属离子后，能够与酵母细胞壁上的酰胺基（-NHCO）、羟基（-OH）和羧基（-COOH）等形成配位结合20，同时可能也加强了胶原纤维与酵母细胞之间的静电作用，从而增强了对酵母细胞的吸附固定作用。ZICF比FICF具有更高的酵母固定量，被用于后续的固定化及发酵研究。 (a) (b) (c)图1 ZICF吸附固定酵母细胞前后的SEM图（a，吸附前1000倍；b，吸附后1500倍；c，吸附后1000倍）Fig.1 SEM images of ZICF before and after immobilizing S. cerevisiae cells(a, ZICF at 1000; b, immobilized cells at 1500; c, immobilized cells at 1000) 图2 pH对ZICF固定酵母细胞的影响（C0 5.26105 cfu/mL，30，5 h）Fig. 2 Effect of pH on the immobilization of ZICF to S. cerevisiae cells2.2 吸附条件对细胞固定量的影响2.2.1 pH对ZICF固定酵母细胞的影响pH对ZICF固定酵母细胞的影响如图2所示。pH的变化会影响ZICF与酵母细胞的配位反应、静电吸附作用及疏水吸附作用，因此pH对酵母细胞在ZICF上吸附机理的影响比较复杂，作者正进行深入研究。但从总体看，pH在2-10范围变化时，对ZICF固定酵母细胞的影响不明显，中性pH值时吸附量稍大。表明在采用ZICF吸附固定酵母细胞的实际操作中，可以不刻意考虑pH的影响。 2.2.2 ZICF对不同菌龄酵母细胞的吸附固定酵母细胞在不同的生长期具有不同的理化和生物学特性，ZICF对它们的吸附固定作用也会发生相应变化。如表1所示，当酵母细胞初始浓度为3.6105 cfu/mL，在pH 6.0和30条件下振荡吸附5 h后，ZICF对稳定期（48 h）酵母细胞固定量最大，而在死亡期（130 h）和生长期（12 h），ZICF对酵母细胞的固定量相对较小。Bowen等人在研究云母对酵母细胞的吸附固定时也发现了类似现象21。这是由于酵母细胞在不同的生长时期其细胞壁的化学结构不同，细胞表面的疏水性差异较大，稳定期酵母细胞表面的疏水性最强，能通过疏水作用增强在ZICF上的吸附，从而导致其在ZICF上具有更大的固定量22,23。对比实验发现，处于稳定期的酵母细胞固定化后，表现了更强的乙醇发酵能力。表1 ZICF对不同生长期酵母细胞的固定量Table. 1 Adsorption capacities of ZICF to S.cerevisiae cells at different growth phase菌 龄12 h48 h130 h固定量（cfu/g）1.011066.681071.58106 吸附条件：C0 3.6105 cfu/mL，pH 6.0，30，5 h2.2.3 离子强度对ZICF固定酵母细胞的影响离子强度的变化会影响ZICF和酵母细胞表面的电荷特性，从而影响ZICF对酵母细胞的吸附固定作用。实验中，通过改变酵母细胞菌悬液中的NaCl浓度，研究了离子强度对ZICF吸附固定酵母细胞的影响。如表2所示，当NaCl浓度0.1 mol/L时，ZICF对酵母细胞的固定量随离子强度的增加而增大，NaCl的浓度达到0.1 mol/L时，固定量达到最大值；当NaCl浓度0.1 mol/L时，其固定量迅速下降。这一现象与Abbott等在研究离子强度对微生物吸附固定的影响时所得结论一致24,25，即在高盐浓度（0.1M）下，微生物与吸附剂之间的亲和力减弱。当然，酵母细胞固定量的变化也可能与其在固化过程中的生长情况有关。NaCl浓度为0.1 mol/L时，是用正常生理盐水配制的酵母细胞菌悬液，有利于酵母细胞的生长，因此表现出较大的固定量；而改变NaCl浓度后，酵母细胞的生长减缓或受到抑制，从而导致测试得到的固定量减少。该项实验结果表明，直接采用生理盐水配制的酵母细胞菌悬液进行固定化反应效果最好。表2 离子强度对胶原纤维ZICF固定酵母细胞的影响Table 2 Effect of ion strength on the immobilization of ZICF to S. cerevisiae cellsNaCl浓度（mol/L）00.010.0吸附量（cfu/g107）2.622.582.846.682.41.1 吸附条件：C0 3.6105 cfu/mL，pH 6.0，30，5 h2.3 吸附平衡用各种吸附平衡方程模拟后发现，ZICF对酵母细胞的吸附平衡符合经典的Freundlich方程2。 (2)式中，qe为平衡吸附量（cfu/g）；ce为吸附平衡时溶液中的细胞浓度（cfu/mL）；k和1/n为Freundlich常数，k和1/n值越大，ZICF对酵母细胞的固定量越大，反之越小。将logqe对logce作图为一条直线，如图3所示。可见，在较高的初始酵母细胞浓度条件下，吸附平衡时溶液中残留的细胞浓度ce越大，ZICF对酵母细胞的固定量也随之增加。试验条件下，ZICF对酵母的固定量随温度的上升变化不大。Freundlich方程拟合所得参数k及1/n值如表3所示。 图3 ZICF对酵母细胞的吸附等温线Fig. 3 Adsorption isotherms of S.cerevisiae cells on ZICF表3 ZICF吸附固定酵母细胞的Freundlich参数Table 3 The Freundlich parameters of S. cerevisiae adsorbed by ZICF 温度（）1/nkR250.3896507.350.9996200.3835405.130.9943300.3390890.370.99042.4 吸附动力学 ZICF吸附固定酵母细胞的动力学过程如图4所示，5 h时吸附趋于平衡。为了进一步了解吸附过程的控制因素及认识吸附机理，分别以拟一级速率方程3、拟二级速率方程4和内扩散方程5对实验数据进行拟合分析26，结果如表4所示。 (3) (4) (5)式中qe为平衡固定量(cfu/g)，qt为t时刻的固定量(cfu/g)，k1为一级速率常数(/min)，k2为二级速率常数(g/(cfumin)，ki为内扩散速率常数(cfu/(gmin0.5)。由表4可知，拟二级速率方程拟合具有较高的相关性，其计算值qe.cal与实测的平衡固定量qe.exp非常接近，误差(qe.exp-qe.cal)/qe.cal 0.5。这说明ZICF对酵母细胞的固定过程主要受细胞在载体表面的吸附速率控制。图4 ZICF对酵母的吸附固定动力学 (C0 5.26105 cfu/mL，pH 6.0，30)Fig. 4 Adsorption kinetics of S. cerevisiae cells on ZICF表4 ZICF吸附固定酵母细胞的动力学参数Table 4 Parameters of adsorption kinetics equations of S. cerevisiae cells on ZICFqe.exp.107 cfu/g拟一级速率模型k1102 qe.cal. R2 /min 107 cfu/g拟二级速率模型k21010 qe.cal. R2 g/(cfumin-1) 107 cfu/g内扩散模型ki108 R2cfu/(gmin0.5)8.202.957.160.9651.348.170.9990.820.857qe.exp和qe.cal分别为酵母细胞固定量的实测值和计算值2.5 固定化酵母发酵试验固定化酵母细胞的乙醇发酵实验情况如图5所示。可见，经ZICF固定后，酵母细胞表现了更高的乙醇发酵能力，一个发酵周期（5天）后，培养基中乙醇含量上升至9.1%(v/v)，乙醇产量比采用游离酵母细胞发酵高32.7%。酵母细胞经固定后，由于胶原纤维的三维立体结构以及发酵所产生二氧化碳对胶原纤维的悬浮分散作用，使得固定化酵母相对于游离酵母具有更好的分散性，这可能是导致固定化酵母具有更高产乙醇能力的主要原因27。此外，也可能胶原纤维为所固定的酵母细胞提供有利的生长微环境，从而提高其乙醇发酵能力。胶原纤维对酵母细胞生长代谢的促进机理还需进一步研究。固定化酵母细胞多次重复使用后，均保持了较高的产乙醇能力。如图6所示，在第12个发酵周期中，乙醇产量仍达到7.8%(v/v)，该乙醇发酵能力优于文献报道的其他固定化酵母细胞22。该乙醇发酵能力接近甚至优于文献报道的部分天然载体固定的酵母细胞的乙醇产量（见表5） 15-19。重复使用12个周期后，扫描电镜观察发现载体的纤维结构保持完好，仍有大量酵母细胞被吸附固定在胶原纤维上，如图7 (a, b)所示，这证明胶原纤维负载Zr之后稳定性增强，具有一定耐微生物降解能力28。此外，图7 (c)中还可以发现酵母细胞在载体ZICF上进行出芽繁殖。这些实验结果表明， ZICF对酵母细胞的吸附固定能力较强，对酵母活性的影响不大，固定化酵母细胞具有较强的乙醇发酵能力，同时能被多次高效地重复使用。图5固定化酵母乙醇发酵 图6 固定化酵母重复使用特性 11Fig 5 Ethanol yield of S. cerevisiae cells immobilized on ZICF Fig 6 Ethanol yield of re-used S. cerevisiae cells immobilized on ZICF表5 不同载体固定酵母细胞在30的乙醇发酵能力(ZICF为28)Fig 5 Ethanol yield of S. cerevisiae cells immobilized on various supports at 30(on ZICF, at 28)载体培养基初始糖含量接种量（g载体/L）细胞固定量乙醇产量（%(v/v)）脱木质素纤维(I. Athanasiadis, et al, 2001)17% 葡萄糖250g/L5.4-7%谷物壳(Nikolaos Kopsahelis, et al, 2007)15.6%糖浆400g/L109cfu/g5.18-7.67%酒糟壳(Nikolaos Kopsahelis, et al, 2007)12P 麦芽汁500g/L4.4-4.9%甘蔗渣(Lei Liang, et al, 2008)15.4%糖浆300g/L1010 cfu/g9.76%橙皮(S. Plessas, et al, 2007)12.8%糖浆400g/L1012-13cfu/g6.5-7.4%ZICF15%葡萄糖3.3g/L107cfu/g7.8-9.1% (a) (b) (c) 图7 12个发酵周期后ZICF固定化酵母细胞的SEM图(a，1500倍；b，1500倍；c，4000倍)Fig 7 SEM images of ZICF-immobilized S. cerevisiae cells after 12 cycles(a, at 1500; b, at 1500; c, at 4000)3 结论胶原纤维可以方便地由原料皮制取，是一类来源丰富的可再生资源。通透性好、易与金属离子发生络合反应，是胶原纤维的基本特性。本研究表明，利用胶原纤维的这些性质，可以制备对酵母细胞具有较高吸附固定能力的负载金属离子载体材料。以酵母为模型细胞，由这类载体材料制备的固定酵母细胞表现出了较强的乙醇发酵能力，并能多次重复使用，证明这类载体材料对酵母细胞的生理生化活性无抑制作用，甚至在一定程度上有所促进，具有工业应用前景。这种微生物细胞固定材料制备方法较简单，固定条件温和，可望被用于固定其它微生物细胞。参考文献1 Isono Y, Araya G, Hoshind A. Immobilization of Saccharomyces cerevisiae on g-alumina particles using spray-dryerJ. Process Biochemistry, 1995, 30: 743-746. 2 Srere N K, Sridhar M, Suresh K, et al. 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