TSS法制备细菌感受态的方法.doc

TSS法制备高效感受态细菌 1）制备1TSS 缓冲液： 在70ml Milli-Q水中加入： 试剂 终浓度 加入量 胰蛋白胨 1 1.0g 酵母提取物 0.5 0.5g NaCl 0.5 0.5g PEG3350 10 10g DMSO 5 5ml 1M MgCl2 50mM 5ml 搅拌，混匀。以HCl或NaOH调pH值至6.5，定容至100 mL。 0.22m过滤。保存在2-8。可保存2-8个月。 （注：保存在4会形成沉淀，可分装成10 mL/tube，保存于-20，用前置于4） 2）按1：100 比例将过夜培养的菌液（16h）加入到新鲜的LB培养基中，于37振荡培养至OD600=0.30.4 (2h 4050min)。4，1000 g，10 min（或者4，4000 rpm，5 min），弃上清，收获细菌。原培养物体积的1/10 体积的1 TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100 uL/份，冰上操作，-80保存。 优点： （1）高转化率，-70保存在18周后，转化率无明显下降。 （2）更重要的是一步操作即可制备感受态菌，简短，转化过程中不需热休克（不过我们做的还是按照CaCl2法，用42 90sec） 这是英文的2X TSS法： Material: 2X Transformation and storage solution (TSS) 20% w/v PEG3350 LB media containing 100 mM MgCl2 pH 6.5 Autoclave Add dimethyl sulfonate (DMSO) to 10 % v/v LB media containing 20 mM glucose 1. Dilute a fresh overnight culture of bacteria 1:100 (1% inocula) into LB medium. Incubate at 37C/300rpm to A600 of 0.3-0.4. 2. Pellet cells at 1000g/4C/10 min. Discard supernant. 3. Resuspend cell pellet at 10% original volume in 1X TSS. Mix gently on ice. 4. Aliquot at 100l. May freeze and store at -80C. Use immediately after thaw 5. 100l competent cells + 1 to 5 pl DNA (0.1 - 100 ng) in ice cold microfuge tube. 6. Incubate 5 - 60 min at 4C. 7. Add 0.9 ml LB medium containing 20 mM glucose. 8. Incubate 30 - 60 min at 37C mild shaking. 9. Plate on appropriate selective medium. TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1TSS的配制：事先配制1M的氯化镁20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取 干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种Dh5，用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶，分别装有30 ml和50mlLB，灭菌后置于4冰箱备用。3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种。其余做转化用。二、感受态制备程序：1、 前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养（12-16h）,按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50 ml LB培养液中，于37 振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h4050min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之 一（这里为5 ml）的1 TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100 ul/份，全部冰上操作，80度保存。三、转化时取一管（100 ul）感受态细菌，（冻存细胞应 置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5ul DNA（0.1100