肺炎双球菌.doc

从微生物学角度（1）肺炎双球菌的结构 肺炎双球菌是一种细菌，属原核生物。由于核区中的DNA分子不与蛋白质结合，因此，用它作实验材料易于单独观察DNA在遗传中的作用。（2）何为荚膜？其作用怎样？荚膜是细菌细胞壁外围绕一层较厚的粘性、胶冻样物质。其化学成分随细菌种类不同而有差异，多数细菌的荚膜成分为多糖，如肺炎双球菌。荚膜的形成受遗传物质（基因）控制。荚膜与细菌的致病性有关，同时荚膜还能储留水分能抗干燥，对保护细菌有作用。荚膜本身无毒性，但在机体内保护细菌抵抗吞噬细胞的吞噬及消化，并能抑制体内杀菌物质（如溶菌酶）的杀菌作用，使细菌易在体内大量繁殖致病。细菌若失去荚膜，致病力也随之减弱或消失。（3）何为菌落？ 菌落是单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的一种肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群。每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。2从分类学角度肺炎双球菌有两种类型：一种是R型细菌，无多糖类的荚膜，是无毒性的；另一种是S型细菌，具有多糖类的荚膜，是有毒性的。R型实际上是S型肺炎双球菌的突变类型，二者属于同一个物种。 3从免疫学角度（1）为何S型细菌会致病，而R型细菌不能致病？ 当细菌进入人或动物体后，由于免疫效应，都要被吞噬细胞吞噬消化，加以消灭。由于S型细菌有荚膜，进入吞噬细胞后，受荚膜的保护，能抵抗吞噬细胞的吞噬和消化，从而能迅速增殖、扩散，引起机体发生疾病。而R型细菌无荚膜，则能被吞噬细胞吞噬、消化，所以不能使机体患病。（2）同是一种S型的肺炎双球菌，为何使人患肺炎，而小鼠患白血病？肺炎双球菌都会使人或小鼠患肺炎，由于小鼠抵抗力差而细菌毒力较强，可并发败血症。（3）何谓加热杀“死”？这里加热的温度一般为60左右，目的使蛋白质变性，细菌的感染力和致病性降低，但抗原的特性仍然存在。（4）加热杀“死”后的S型细菌，其细胞中的DNA是否变性？由于DNA具有相对稳定性，把DNA溶液加热到沸点，就可以使氢键断开，双螺旋解体，DNA分子急剧变性，转化活性也急剧下降，但如果将其缓慢冷却，分离了的DNA单链，就可以得以重聚。恢复其双螺旋结构，即DNA的“复性”。这样，学生就能理解为什么加热杀死肺炎双球菌后，只要将其逐渐冷却与R型活菌混合在一起，就能使R型向S型转化，因而杀死小鼠。 4 从遗传学角度（1）何为转化？其实质是什么？影响转化的因素有哪些？转化作用是指一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质（DNA或RNA），而表现出后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。转化的实质是外源DNA与受体细胞DNA之间的重组，使受体细胞获得了新的遗传信息。因此，转化作用可以看成广义上的基因重组。影响转化的因素有：供体细胞DNA的纯度。DNA越纯，转化率就越高。两种细菌的亲缘关系。亲缘关系越近，转化越容易。受体菌状态。只有处于感受态的受体菌才能被转化。受体细胞从外界直接吸吸收来自供体细胞的DNA片段，并与其同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传特性的现象，称为转化。 （2）R型肺炎双球菌如何转化为S型肺炎双球菌？加热灭活的S型细菌遗留下各个DNA片段，其中包括控制荚膜形成的基因，这些片段从S细菌中释放出来，并且在后继的培养中被一些R型细菌所摄取，进入R型细菌的细胞中，以同源重组的置换方式，整合进入R型细菌的基因组中，使R型细菌转化成S型细菌。可见，转化后形成的S型细菌内含有两种DNA（R型和S型）。而S型有荚膜，无“感受态”，在自然情况下很难接收外源DNA分子，不能作用受体菌，故不能转化。在自然情况下，R型变成S型是通过基因突变来实现的。(3)如果感染了S型肺炎双球菌，S型菌的DNA能不能进入人或小鼠的细胞？ 5从实验学角度（1）实验构思 该实验设计中最关键的思路是什么？从活的S型细菌中提取、分离和鉴定出各种成分，分别与R型细菌混合培养，并观察其后代是否有S型细菌出现。 （2）实验过程（3）实验对照分析在体内转化实验中，之间形成相互对照，每一组既是实验组，又是其他组别的对照组。在体外转化实验中，该实验所研究的实验因素为DNA，故用DNA处理的组为实验组，而蛋白质或多糖虽然是实验所实施的处理因素，但与实验因素（DNA）无关，故组之间形成条件对照，其中组为实验组，组为对照组；而组和组之间形成空白对照，其中组为实验组，为对照组。（4） 实验结论 利用该实验能否证明蛋白质不是遗传物质？该实验能证明蛋白质不是遗传物质，因为在体外转化实验中，用S型的蛋白质与R型细菌混合后，培养基中未出现S型菌落，说明蛋白质不是转化因子。例1肺炎双球菌转化实验中，将加热杀死的S型细菌与R型活细菌相混合后，注射到小鼠体内，在小鼠体内S型和R型细菌含量变化情况如图所示。下列有关叙述中错误是的（ ） A在死亡的小鼠体内存在着S型和R型两种细菌B曲线ab段下降的原因是R型细菌被小鼠的免疫系统所消灭C曲线bc段上升，与S型细菌在小鼠体内增殖导致小鼠免疫力降低有关DS型细菌数量从0开始是由于R型细菌突变的结果解析：本题以经典实验为素材，综合考查R型和S型细菌的特点及细菌发生转化的原因，引导学生对教材实验作进一步思考。R型细菌的数量与小鼠免疫力有关，S型细菌的产生是由于R型细菌转化的结果，而非基因突变所致。答案为D。例2证明DNA是遗传物质的肺炎双球菌体外转化实验中，设置了以下几组：下列有关叙述中，错误的是A该实验设计的关键是将细菌的各组分分离开来分别进行实验B组之间形成条件对照，其中组为对照组，组为实验组 C和组之间形成空白对照，其中组为实验组，为对照组D实验成功证明了DNA是遗传物质，但不能证明蛋白质和多糖不是 解析：该实验所研究的实验因素为DNA，故用DNA处理的组为实验组，而蛋白质或多糖虽然是实验所实施的处理因素，但与实验因素（DNA）无关，故组之间形成条件对照，、组均为组的对照组；而组（实验组）和组（对照组）之间形成空白对照。该实验也为蛋白质或多糖创造了参与转化的机会，但由于它们未能实现转化，故能证明蛋白质和多糖不是遗传物质。答案为D。 在某些化学或物理条件的诱导下，外源DNA可以比较容易地进入真核细胞，这一过程称为转染。可是在生理条件下，外源DNA进入细胞之前就被机体组织内的各种核酸酶彻底水解和破坏了，即使有少量核酸没有被完全水解，也无法通过正常途径穿过细胞膜，进入细胞内并运送到核。另外，发生转化的生物间必须有一定的亲缘关系，肺炎双球菌的S型和R型是同一物种的两个品系，较易发生转化，细菌与人或小鼠之间的亲缘关系较远，几乎不能转化。 供体细胞DNA片段即为格里菲斯认为的“转化因子”，R型细菌肺炎双球菌（受体细胞）在对数期后期（生长后期）40分种内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其它时期大1000倍。此时R型活菌（受体细胞）膜表面有3080个“感受态因子”位点。“感受态因子”是一种膜外蛋白，可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来。被加热杀死的S型肺炎双球菌自溶，释放出的DNA片段（已失活），但双键结构尚在，分子量小于1107含有15个基因，即“转化因子”。当“转化因子”遇到咸受态的R型活菌，就有10个左右这样的双链片段与R型菌膜表面的“感受态因子”位点结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为41065106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条链降解，另一条单链进入细胞，与受体菌基因的相应同源区段配对，并使受体菌基因的相应片段被切除，从而将其替换，形成杂种DNA区段。随着受体基因进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一个类似受体菌。当细胞分裂后，复制的基因发生分离，于是就有R型菌产生S型菌肺炎双球菌的后代，此过程称为原核生物的转化。其实质是基因重组。对肺炎双球菌转化实验的几点思考四川成都棠湖中学外语实验学校何小波张亚萍在讲授DNA是主要的遗传物质一节中，学生对肺炎双球菌的转化实验提出了几点质疑。笔者在经过认真思考、讨论、查阅资料后，针对各个问题一一进行了解答。笔者发现学生提出的疑问很有意义和代表性，现将学生质疑和笔者解答整理如下，供同仁参考。也求抛砖引玉，获得更好的解答。1格里菲斯的体内转化实验实验中将加热杀死的S型和活的R型混合注射到小鼠体内，小鼠患败血症死亡，并从小鼠体内分离出活的S型，且其后代仍是有毒性的S型。格里菲思推论：在已经加热杀死的S型细菌中，必然含有一种“转化因子”，促使R型转化为S型，且这种转化可遗传。11 质疑一：是S型复活还是R型被转化？学生的质疑：为什么是R型被转化，而不是加热杀死的S型复活呢？笔者的分析解答：学生提出这样的质疑，主要是对蛋白质的化学性质不太了解。蛋白质具有一定的空间结构才具有生理活性，加热会破坏蛋白质的空间结构（变性），且该过程不可逆。所以加热后蛋白质变性失活，不可能再恢复其功能（可以高温下酶失活为例）。而蛋白质是生命活动的承担者，蛋白质失活了，生命活动就不可能再恢复，也就是说热杀死的S型是不可能复活的。当笔者作出上边的解释后，有学生立即又提出了下面的质疑。12 质疑二：加热杀死的S型的DNA为什么没被破坏还可以发挥转化作用？学生的质疑：加热杀死的S型菌的蛋白质变性失活了，失去了生理功能。那为什么热杀死的S型的DNA还有作用呢？笔者的分析解答：学生提出这样的质疑，和上一个问题的原因相似，主要是对DNA的结构及化学性质不太了解。DNA是由两条链形成的双螺旋结构，两条链间碱基通过氢键连接。加热会使氢键断裂，使DNA双螺旋解开成单链，称为DNA变性。但和蛋白质变性不同的是，当温度缓慢降低时单链又可以重新形成双链，称为DNA复性。所以，加热杀死的S菌的DNA还是有作用的。13 质疑三：转化因子是S型菌的整个DNA，还是DNA片段？学生的质疑：发挥转化作用的到底是S型菌的整个DNA，还是DNA片段？笔者的分析解答：这个问题涉及的是DNA分子变性、复性、以及基因的有关知识。通过查阅资料发现：常用的DNA变性方法主要是热变性方法和碱变性方法。热变性使用得十分广泛，但是高温可能引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链DNA。而碱变性方法则没有这个缺点，在pH为113时，全部氢键都被淘汰，DNA完全变成单链的变性DNA。决定生物性状的基本单位叫做基因，它是DNA上具有遗传效应的片段。S菌的DNA上具有与荚膜形成有关的片段（基因），加热杀死S菌时，S型菌的DNA可能因高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链DNA。所以加热杀死S菌的时候，会得到与荚膜形成有关的DNA片段。该片段与R菌DNA整合后，使得其也可以形成荚膜，即转变为S型。14 质疑四：S菌的DNA将R菌转化，还是S菌的DNA直接控制合成了S菌？在本节教学中，笔者补充了证明RNA是遗传物质的实验烟草花叶病毒侵染实验。学生在知道烟草花叶病毒的RNA侵染烟草细胞后，利用其所带的遗传信息控制合成了新的烟草花叶病毒的知识后，对肺炎双球菌体内转化实验又提出了新的质疑。学生的质疑：为什么是S型菌的DNA转化了R型，而不是S型菌的DNA像烟草花叶病毒的RNA侵染烟草细胞后直接控制合成了S菌？笔者的分析解答：学生发生这样的疑问是因为对病毒的结构和复制、细菌的结构和繁殖的知识掌握的不够清晰，不能区分这两种生物的特征。病毒是非细胞结构的生物，由蛋白质外壳和核酸组成，子代病毒是通过病毒核酸（遗传物质）在宿主细胞中控制合成的核酸和蛋白质组装而成。而细菌是细胞结构生物，细胞通过分裂实现增殖，也就是说新细胞只能来自于细胞的分裂，而不可能来自于其他细胞直接合成。所以该实验中应该是S型菌的DNA转化了R型菌，而不是像烟草花叶病毒侵染实验那样直接控制合成了S菌。2艾弗里的体外转化实验艾弗里和他的同事为了弄清转化因子是什么，分离提取了S菌的DNA、蛋白质和多糖等物质，然后分别加入已培养R型细菌的培养基中，结果发现：只有加入DNA，R型细菌才能转化为S型细菌。艾弗里还发现：如果用DNA酶处理S型菌的DNA，使DNA分解，就不能使R型细菌发生转化。21 质疑一：如果在S菌的培养基中加入R菌的DNA，S菌能否被转化为R型？学生的质疑：如果在S菌的培养基中加入R菌的DNA，S菌是不是也能整合R菌的DNA，从而被转化为R型？笔者的分析解答：由于缺乏相应的微生物知识，对R型细菌转化的具体生理过程不清楚，很容易认为在S菌的培养基中加入R菌的DNA，S菌也能整合R菌的DNA，从而被转化为R型。R型细菌之所以能整合S型菌的有关DNA片段，转化为S型，与其自身的结构和特性有关。R型活菌在对数期后期内处于“感受态”（ 细菌能从环境中摄取DNA进行转化的状态，称感受态(competence)。 对于感受态本质的解释，有人认为处于感受态的受体菌局部失去了细胞壁，使外源DNA能顺利经膜进入菌体，称局部原生质体假说。也有人认为是受体细胞表面出现了一直能结合DNA并使之进入细胞的酶，称酶受体假说）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段，当DNA片段遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜上的结合位点相结合，随后其中一条链被细胞膜上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条单链推进受体细胞（该过程称为DNA的结合和摄取）。当单链进入受体菌细胞后，便与受体菌DNA上的同源区段发生交换重组。再通过受体菌DNA复制、细胞分裂，而表现出转化的性状，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。而S型肺炎双球菌有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，所以在S菌的培养基中加入R菌的DNA，S菌不能被转化为R型。当然S型菌在自然状态下或人工的诱变下发生基因突变，S型菌可能突变为R型，但不是转化。22 质疑二：艾弗里的第三组实验（加DNA水解物）为什么没能排除人们对其实验的怀疑？学生的质疑：艾弗里在第三组实验（加DNA水解物）中，用DNA酶处理提取的DNA，然后加入培养R型菌的培养基中，结果培养基中未出现S型。这个实验从反面证明了DNA是遗传物质，为什么不能排除人们对提取的DNA中含有002%的蛋白质起到了转化因子（遗传物质）的作用的怀疑？笔者的分析解答：这个推理从理论上来说确实没错，但是实际上，当时情况要复杂的多。当时人们对艾弗里实验结果表示怀疑的原因主要来自两个方面。一方面：艾弗里的实验并非无懈可击，人们发现他的第一个实验中的DNA纯度不够，关键性的实验证据出现了问题，由此证据得到的推论自然会被人们怀疑。尽管艾弗里的第三个实验能做出一些解释，但是人们仍然可以认为是DNA和蛋白质共同作用完成细菌的转化，或者蛋白质也参与了细菌的转化过程，即无法完全排除蛋白质可能起了作用的怀疑。另一方面：艾弗里由实验推论得到DNA是使R型细菌发生遗传改变的物质，这个观点与当时大多数科学家的观点是截然不同的，因此很多人都不愿承认艾弗里的实验结果，这一点从他一生的遭遇就可以看出。自1930年起，几乎每年艾弗里都因发现肺炎双球菌的抗原特异性取决于其多糖荚膜而获诺贝尔奖提名，但由于当时人们普遍认为抗原特性取决于细胞表面的蛋白质，不相信艾弗里的结果，怀疑其结果是因为多糖掺杂了蛋白质杂质导致的。在1946年以前，艾弗里有4次进入了第二轮名单，即诺贝尔奖委员会对其工作做了书面评价，但是评价的结果都认为他的发现不值得获奖。1946年起，开始有人在提名艾弗里时提到他对遗传物质的研究。当时研究核酸的两个权威卡罗林斯卡医学院的化学教授艾纳哈马斯登和他的前学生，细胞研究与遗传学教授托布真卡佩森。这两个人都相信只有蛋白质才有可能是遗传物质，而且他们根据自己的研究经验，知道很难除去DNA中的蛋白质杂质，从而不相信艾弗里的实验结果。1946年，由哈马斯登对艾弗里的实验做了简短的书面评价，他对艾弗里的结果持批评态度，认为艾弗里的DNA是被蛋白质杂质污染