基质金属蛋白酶MMP1及其抑制因子TIMP1在子宫内膜异位症中的表达及意义.doc

基质金属蛋白酶MMP1及其抑制因子TIMP1在子宫内膜异位症中的表达及意义【摘要】目的研究基质金属蛋白酶1（MMP1）及其抑制因子TIMP1mRNA和蛋白在子宫内膜异位症（EMs）异位和在位内膜组织中的表达，探讨其在子宫内膜异位症发生发展中的作用。方法应用反转录聚合酶链反应（RTPCR ）和免疫组化SP法检测43例EMs的异位和在位内膜及20例正常子宫内膜中MMP1，TIMP1mRNA及蛋白的表达水平。结果在EMs异位内膜中MMP1mRNA及蛋白均呈高表达，TIMP1mRNA及蛋白均呈低表达，与EMs在位内膜和正常内膜相比，差异有显著性，P005。MMP1/TIMP1比值在异位内膜和在位内膜分别为146057，115038，均显著高于正常内膜（P005）；而且异位内膜中比值1的几率（33/39，846%）明显高于在位内膜（P005），两者呈显著负相关。异位内膜组织中MMP1，TIMP1mRNA及蛋白的表达无周期性变化，但与rAFS临床分期有相关性（P005）。结论异位内膜组织中MMP1高表达，TIMP1低表达，导致MMP1/TIMP1平衡失调，使异位内膜组织具有更强的侵袭能力，在EMs的发生发展中发挥重要作用。 【关键词】 子宫内膜异位症；基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制因子；反转录聚合酶链反应；免疫组织化学子宫内膜异位症（EMs）是妇科常见的一种良性病变，但却具类似恶性肿瘤的生物学行为，其发病机制至今尚未阐明。近年研究表明，细胞外基质（extracellular matrix， ECM）的降解与重建是异位内膜侵袭并种植于腹膜的关键因素1。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一组锌依赖性的、在结构上高度同源的蛋白水解酶，是降解ECM成分的最显要的一组酶类2，其活性在体内受到天然组织抑制剂金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）的特异性抑制。MMPs与TIMPs间的平衡调节对于协调ECM降解与重建、维持ECM内环境稳定和结构完整具有重要作用。目前研究表明EMs患者的在位及异位子宫内膜均可分泌MMPs及TIMPs，推测其在EMs的发生发展中可能具有重要意义。本实验应用免疫组化SP法和RTPCR技术检测子宫内膜异位症异位和在位内膜中MMP1 和TIMP1 的表达，以探讨MMPs/TIMPs在EMs发生发展中的作用。1 材料和方法11 对象 45例EMs异位内膜组织标本均来自本院2003年7月—2005年4月因EMs而行手术的患者，平均年龄（35564）岁，其中增生期25例，分泌期20例。根据rAFS分期标准，期20例，期16例，期9例。22例EMs在位内膜标本取自上述因EMs行子宫切除的患者，其中增生期14例，分泌期8例。另取同期因子宫肌瘤而行子宫切除术患者正常子宫内膜20例为对照组，平均年龄(35548)岁，其中增殖期子宫内膜12例，分泌期8例。所有患者术前3个月内均未接受任何激素治疗，术后均经病理学诊断证实。月经周期的划分根据末次月经及子宫内膜病理检查结果确定。12 试剂 MMP1 ，TIMP1 鼠抗单克隆抗体、SP试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司；反转录试剂盒、TRIzol试剂盒均为美国Promega公司产品。引物由上海生工生物工程公司合成。13 检测方法及结果判定131 免疫组化SP法 试验步骤按说明书进行，DAB显色，PSB代替一抗作阴性对照，已知阳性染色的乳腺癌组织切片为阳性对照。阳性细胞为光镜下细胞浆或胞膜中出现明确的棕黄色颗粒，参照Shimizu等3方法，随机选取5个高倍视野，综合染色强度和阳性细胞分布进行分析。132 RTPCR 总RNA的提取利用TRIzol试剂盒完成，cDNA合成参照反转录试剂盒标准条件进行，所得cDNA用作模板进行PCR扩增。MMP1的引物序列为5CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA3及5AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT3；TIMP1的引物序列为5ATCCTGTTGTTGCTGTG3及5GACTGGAAGCCCTTTTCAGA3 反应；内参照GAPDH基因的引物序列为5CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA3及5ATGATCTTGAGGCTGTTGTCAA3。三者的扩增片段分别为786 bp，520 bp及450 bp。MMP1和GAPDH的扩增参数为95 45 s，57 45 s，72 1 min，33个循环，最后72 延伸5 min。TIMP1和GAPDH基因的扩增参数为95 40 s，59 50 s，72 1 min 共33个循环，最后72 延伸5 min。取10 μl 扩增产物于含溴化乙锭（05 mg/L）的2%琼脂糖凝胶中电泳，80 V，1 h，用DNA100作为分子量标准，利用VADAS 21系统（德国OPTON公司）进行图像扫描分析。14 统计学方法 应用SPSS115软件包分析资料，采用t检验、χ2检验、精确概率法、KruskalWallis检验及相关分析。2 结果21 MMP1，TIMP1蛋白的分布及表达 MMP1，TIMP1蛋白主要分布于子宫内膜腺上皮和内膜基质中。MMP1蛋白在EMs异位内膜中表达较强，以（+）（+）为主，在异位内膜间质细胞中的表达尤为丰富，阳性表达率高达41/45（911%），显著高于正常内膜和EMs在位内膜相比P005，而在后二者之间差异无显著性。TIMP1蛋白在EMs异位和在位内膜中均呈弱阳性表达，以（+）（+）为主，明显低于正常内膜（P005）。详见表1。表1 MMP1，TIMP1蛋白在各组子宫内膜组织中的表达（略）与正常子宫内膜组相比,P0.01,P0.05;与EMs在位内膜相比,P0.052.2 MMP1，TIMP1mRNA的表达 EMs异位内膜中MMP1mRNA的表达量显著增高，TIMP1mRNA的表达量显著降低，与正常内膜相比差异有显著性（P0.01），而且二者在异位内膜中的表达有相关性（P0.05）。TIMP1mRNA在EMs在位内膜中的表达也明显低于正常内膜（P0.05）。详见表2。2.3 MMP1/TIMP1mRNA比值分析 EMs异位和在位内膜中MMP1/TIMP1mRNA比值明显高于正常内膜（P0.05）。表2 MMP1，TIMP1mRNA在各组子宫内膜中的表达（略）与正常内膜相比,P0.05;与EMs在位内膜相比,P0.05）；而与rAFS临床分期具有相关性，随rAFS临床分期的增高而分别增加或降低（P0.05）。3 讨论子宫内膜异位症的发病学说纷纭众多，但仍以子宫内膜细胞随经血逆流种植为主导理论。依此学说，内膜细胞必须突破腹水、腹腔细胞及ECM，才能完成黏附、侵袭、血管形成的过程。研究表明基质金属蛋白酶在异位内膜生长、浸润、种植多个环节对ECM和基膜的降解起重要作用。MMP1是MMPs 家族中的主要成员，作用底物主要是纤维类胶原，其中，型胶原是ECM嗜银网状纤维的主要成分，是细胞发生侵袭转移必须跨越的屏障。既往研究发现4，间质中MMP1的表达强度与嗜银纤维网的破坏和基质崩解密切相关，在仅有腺上皮表达的病灶中，很少观察到网状纤维的破坏和基质崩解。本实验发现MMP1mRNA及蛋白在EMs异位内膜中的表达量显著增强，且MMP1蛋白在异位内膜间质中的表达尤为丰富，阳性表达率高达91.1%（41/45），明显高于正常子宫内膜间质。因此认为MMP1在异位内膜组织中的过强表达，尤其在异位内膜间质中的过强表达，使其更易降解ECM网状纤维中的I型和III型胶原纤维，使网状纤维结构破坏，基质崩解，导致异位内膜向周围组织不断侵袭、种植，使异位病灶不断扩大，在子宫内膜异位症的发生发展中发挥重要作用。在体内，MMP1的水解活性受其天然特异性组织抑制因子TIMP1的紧密调控，生理状态下，MMP1与TIMP1之间存在着一种动态平衡，这种平衡是协调ECM降解与重建、维持内环境稳定和结构完整的重要因素。本实验研究发现，异位内膜组织中MMP-1mRNA及蛋白的表达明显增高，TIMP1mRNA及蛋白的表达明显降低，MMP1/TIMP1mRNA比值明显增高，MMP1与TIMP1之间的动态平衡被打破。TIMP1的低表达使其对MMP1蛋白水解活性的抑制作用减弱，MMP1降解ECM的能力增强。因此认为，MMP1/TIMP1平衡失调使EMs异位内膜较正常子宫内膜具有更强的向周围组织侵袭的能力，在子宫内膜异位症的发生发展中发挥重要作用。近年研究发现EMs患者与非EMs患者的在位内膜之间存在差异，EMs在位内膜的蛋白水解能力强于正常内膜，但又较异位内膜差，呈现出独特的分子生物学特征，从而提出在位内膜决定论的新观点，这也是解释EMs家族倾向和遗传性的理论基础5。本实验研究发现TIMP1mRNA及蛋白在EMs在位内膜中的表达低于正常子宫内膜，MMP1/TIMP1mRNA比值明显增高，TIMP1与MMP1之间平衡失调，使MMP1破坏和降解ECM的蛋白水解活性增强。当此种内膜组织随经血逆流入腹腔并与腹膜发生异位黏附后，侵袭并种植于腹膜的能力较正常内膜增强，从而更易于在腹腔内种植生长形成异位病灶，进一步佐证了在位内膜决定论的观点。这与SharpeTimms等6应用原位杂交法研究的结果相一致。但是，EMs在位内膜在EMs发病机制中是因是果，即在位内膜MMPs/TIMPs的失衡是导致最初腹膜异位种植、发生EMs的原因，还是由于发生EMs后机体内环境改变而致在位子宫内膜发生的变化，尚有待于进一步研究。子宫内膜异位症是一种慢性进行性疾病，病情常常不易控制而进行性加重。本研究结果显示，EMs异位内膜中MMP1，TIMP1的表达与rAFS分期有相关性，随着EMs严重程度的增加，MMP1含量有增高的趋势，而TIMP1有降低的趋势。动物实验研究认为MMPs的过度表达与细胞的浸润行为和转移倾向存在正相关，MMPs的过度表达可增强细胞的侵袭和种植能力。随着EMs严重程度的增加，异位病灶中MMP1含量逐渐增高，TIMP1逐渐降低，MMP1/TIMP1平衡严重失调，MMP1水解ECM的活性不断增强，从而使富含MMP1的异位内膜不断侵袭破坏周围组织屏障，使病灶不断蔓延扩大，使病程不断进展加剧，这可能是EMs病程不断迁延进展且难以根治的重要原因之一。同时异位病灶的周期性出血和脱落再种植也可能是EMs不断进展的重要因素。因此，在临床上早期发现、早期治疗是控制异位症病情进展，减轻病人痛苦的有效措施。【参考文献】 1Witz C A, MonotoyaRodriguez I A, Schenken R S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesionJ.Fetil Steril,1999,71(1):56-60.2Amy R, Barbara,Mace L,et al. Matrisian:matrix metalloproteinases:biologic activity and clinical implicationsJ.J Clin Oncol,2000,18(5):1135.3Shimizu M,Saitch Y,Itoh H.Immunohistochemical staining of Haras oncogeproduct in normal, benign, and malignant human pancreatic tissuesJ. Hum Pathol, 1990,21:607.4Kokerin I, Eeckhout Y, Nisolle M,et al. Expression of interstitial collagenase (matrix metalloproteinase1) is related to the activity of human endometriotic lesionsJ. Fertil Steril,1997,68:246-251.5郎景和.子宫内膜异位症的研究与设想J.中华妇产科杂志,2003,38(8):478-480.6SharpeTimms K L, Muscol