微型DNA条形码用于猛禽物种鉴定.doc

微型DNA条形码用于猛禽物种鉴定高 航摘要：以猛禽为研究对象，首先采用模拟实验(in silico analysis)，将BOLD数据库中230个样本的序列拆成3或6段相同大小(216 bp或108 bp)的片段，选用Full-barcode、Mini-barcode216-1和Mini-barcode 108-1三个片段数据集以K2P为参数构建NJ树，并进行遗传距离分析得出解析度的准确性依次为84.1%、78.3%、75.2%；然后进行实验验证(Empirical test)，设计PCR引物扩增40个样本的DNA条形码指定序列5 端114 bp、中间103 bp和3 端121 bp，分别以单一片段和两两组合后的片段序列数据集为分析基础计算物种鉴定的准确性，得出114+103 bp合并序列为85.0%、114+121 bp为85.7%。因此，微型DNA条形码(Minimalist barcode)鉴定猛禽物种是可行的，和DNA条形码一样均可作为猛禽物种鉴定的可靠依据。关键词：猛禽；DNA条形码；微型条形码；物种鉴定 Minimalist-barcoding on the Species Identification of RaptorsAbstract This study testified the feasibility of species identification of Raptors with minimalist barcodes. We first tested the in silico performance of mini-barcodes (216 bp or 108 bp) in species-level identifications of 230 COI sequences from BOLD system, and calculated the resolution of three segments of full-barcode, mini-barcode 216-1 and mini-barcode 108-1 by neighbour-joining (NJ) analysis. With the segments decreasing, the resolution of species identification lowered (84.1%, 78.3% and 75.2%, respectively). However, the choice of length and position of mini-barcodes was important in their ability to discriminate among species. We generated 111 mini-barcodes (100 bp) from 5 end, middle and 3 end of DNA barcode, respectively. The combinated segments of 114+103 bp and 114+121 bp showed higher accuracy at 85.0% and 85.7%, as compared to others in species-level identification by NJ analysis. The mini-barcodes which produced species-level resolution congruent with DNA barcode were also valuable for the identification of the raptors species whose DNA were degraded.Key words: Raptors; DNA barcode; Minimalist-barcode; Species identification猛禽是鸟类六大生态类群之一，涵盖了鸟类传统分类系统中隼形目和鸮形目的所有种，包括鹗、鹰、鸢、雕、鹫、鹞、鵟、隼、鸮、鸺鹠等次级生态类群，均为掠食性鸟类(李湘涛，2004)。随着年龄、性别、季节和亚种的不同，猛禽在形态上会出现显著变异，对这些猛禽的准确识别鉴定便成为了生物保护工作的基础。过去，人们一直采用传统的形态学分类方法，该方法的一些缺陷造成了生物保护工作的局限(莫帮辉等，2008)。随着现代分子生物技术的发展，利用DNA序列片断信息对生物进行种类鉴定、物种分类地位及种间亲缘关系探讨正在成为一个主流手段。其中，Hebert提出的线粒体COI基因指定片段(648 bp)为基础的DNA条形码(DNA barcode)是目前高等脊椎动物，包括鸟类选用的对物种进行鉴定的标准化DNA片断(Hebert et al.,2004b; Yoo et al., 2006; Kerr et al.,2007)。DNA条形码是对形态学方法的强有力补充，它可使对物种的鉴定过程实行自动化、标准化和全球化，是分类学家十分有益的分子工具(Schindd and Miller,2005)。但是，通过DNA条形码来鉴定物种对样本的质量有较高的要求，使其存在一定的局限性。当样本质量不高、存在DNA降解情况时，常常难以获得完整的DNA条形码信息(即得不到完整的COI基因指定648 bp片段)，给物种的有效鉴定带来困扰（Hajibabaei et al.,2005）。因此，一直以来，条形码库建设的重点对象是新鲜样本，然而目前很有必要将新鲜样本与数以百万计的馆藏标本进行比较分析，尤其是当DNA条形码显示出一些曾被视为同一种物种的隐种，还有一些以传统的形态学方法难以鉴别的物种（未发育的幼虫，缺损不完善的样本等）的时候，显得更为迫切；同时，馆藏标本的DNA条形码研究对于构建覆盖地域更广，更为准确完善的条形码库也具有积极推动作用。博物馆标本的年代都较为久远（10-50年），并且其中一个主要缺陷是它们的采集和保存的方式用于分子生物学研究不是很理想，虽然有足够数量的损伤DNA，但是它们大都降解成了较小的片段（约100 bp），由此，通用引物就显得无能为力，相对而言，100 bp左右的序列易于扩增获得。因此，Hebert探讨了选取DNA条形码指定序列中100 bp长度的序列进行物种鉴定，分析表明，该长度的序列同样适用于物种鉴定。微型DNA条形码(Minimalist barcode，简写为mini-barcode)即是针对博物馆标本的鉴定提出的（Hajibabaei et al.,2006）。本研究以猛禽为研究材料，首先采用模拟实验，将BOLD数据库中230个样本的序列拆成3或6段相同大小(216 bp或108 bp)的片段，计算出Full-barcode和Mini-barcodes用于物种鉴定的准确性；然后进行实验验证，测定40个样本的DNA条形码指定序列5 端114 bp、中间103 bp和3 端121 bp，分别以单一和两两组合后的片段序列数据集为分析基础计算物种鉴定的准确性，探讨微型DNA条形码用于猛禽物种鉴定的可行性。1 材料与方法1.1 材 料模拟实验中猛禽230个样本COI序列来自BOLD数据库(Barcode of Life Data Systems, /views/login.php)，包括猛禽鸮形目2科10属28种、隼形目2科22属60种230个样本序列（见附录2）；实验验证中猛禽馆藏标本鸮形目1科3属3种、隼形目2科9属12种共23个样本，新鲜组织样本鸮形目2科2属4种、隼形目2科5属8种共17个样本（见附录1）。1.2 方 法1.2.1 模拟实验(in silico analysis)将BOLD Systems中猛禽230个样本COI序列同小家鼠线粒体COI基因全序列用Clustal X(Thompson et al,1997)进行比对后，用 Bio-edit 软件截取对应于小家鼠从第58位到第705位碱基的648 bp片段，获得符合DNA条形码协会指定标准的DNA条形码。然后将比对形成的数据集按表2所示的方式分别拆成长度为216 bp和108 bp的2种Mini-barcodes片段数据集，联合648 bp分别依次记为Full-barcode、Mini-barcode216-1、Mini-barcode216-1，等。用MEGA4.0软件（Tamura K et al,2007）分别计算这10个片段数据集的变异位点、简约位点、种内差异和种间差异；同时我们选用Full-barcode、Mini-barcode216-1和Mini-barcode108-1三个片段数据集分别构建NJ树(Neighbor-Joining)，NJ树模型选择适用于核酸序列分析的K2P(Kimura 2-parameter)参数模型(Kimura,1980)，并且各分枝的置信度用自展法(Bootstrap)1000次重复检验，其余使用缺省的参数，计算K2P (Kimura 2-parameter)遗传距离，并计算NJ树解析度的准确性。1.2.2 实验验证(Empirical test) DNA提取馆藏标本DNA提取：采集23个猛禽标本趾垫部位的残留肌肉组织样或部分脚趾骨骼样。每个标本取组织5-10mg，用无菌的手术刀片切碎后采用DNeasy tissue extraction试剂盒（QIAGEN, German）的蛋白酶K/DTT/SDS方法消化后，先加入粪便提取试剂盒（OMEGA, USA）中的SP2去除杂质、部分色素和HTR去除大量对后续PCR反应的抑制剂（冰上操作），随后步骤按照DNeasy tissue extraction 试剂盒（QIAGEN, German）的流程操作。每次提取均作空白对照且按单一物种分别提取，整个提取过程及后续的实验操作都在一个标本研究专用的房间里进行。新鲜组织DNA提取：无水乙醇保存的肌肉组织先用去离子水清洗2次，捣碎后与EDTA抗凝的血液一样加入裂解缓冲液中（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA, 1% SDS, 200 g/mL蛋白酶K），混匀后转入摇床（55, 80 rpm）过夜消化。8 10000g 离心5 min，取上清，等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提2次，加入1/10 体积的3 M醋酸钠（pH 5.3）和等体积的异丙醇，4 15000g离心8 min，去上清，75%酒精洗涤1次，4 15000g 离心5 min，去上清，干燥后加入50 L TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA），4保存备用。每次提取均作空白对照。 引物设计模拟实验中32属猛禽样本各选取1条共32条序列用Clustal X 进行比对，从片段长度（30年），考虑到DNA降解严重扩增片段212 bp过长的原因，进而我们将反向引物向里又移动了64 bp，可仍然扩增失败，建议采用全基因组扩增增大模板量后再进行特异扩增。Hajibabaei et al.曾采用3 端407 bp和5 端135 bp两种微型条形码对哥斯达黎加膜翅目茧蜂科茧蜂属的91个个体进行物种鉴定，准确率达到79.1%（Hajibabaei et al.,2006）；范京安等采用5 端160 bp、50 bp对果实蝇49个个体进行物种鉴定，准确率分别为94%、84%（范京安等，2009），由此，本研究分别设计三段片段扩增引物扩增5 端114 bp、中间103 bp和3 端121 bp，并分别以三个单一片断和三个两两组合的片段数据集为分析基础构建NJ树进行物种鉴定。从树图（图2）可以看到6个片段数据集都不能将棕翅鵟鹰鉴定出来（种间差异很小0.9%），原因是鵟属和鵟鹰属比较近缘彼此经常杂交(Hebert et al. ,2004a)，而且Riesing等在2003年关于鵟属的系统进化研究中曾经提到大鵟、普通鵟等属于鵟属的最近的旧大陆辐射产生的物种( Riesing et al.,2003)，可见它们是新近分化的年轻物种。隼科的红隼和黄爪隼种间差异较小（1.4%）却不能区分，而猎隼和红脚隼只有3 端121 bp参与鉴定才能区分，而5 端114 bp、中间103 bp都不能区分，虽然种间差异很大（9.0%），却聚到一起不能很好的区分，原因在于我们隼属样本过少，而且大部分一个种的样本只有一个个体，再加上隼属亲缘关系较近，彼此间种间差异较小，平均为9.3%，形成了一个最大种内差异（4.3%）和最小种间差异（1.4%）的重叠区，因此单纯依靠“10规则”不能有效的对物种进行准确鉴定，尤其当条形码序列有不同的单倍型的时候鉴定就更为困难，这就要结合传统分类学才能准确的进行物种鉴定。从6个片段数据集构建的NJ树图比较来看，单一的片段对猛禽物种鉴定的准确性远小于两两组合片段。5 端114 bp对鹰科和隼科的物种鉴定效果最差，中间103 bp对隼科和鸮形目不能很好的区分，相互嵌套，交叉聚类，两者结合则能较好的对鹰科和鸮形目的物种进行分类。相对来看，3 端121 bp单一片断以及与前两段的组合片段除扩增失败的9个个体外，对剩下的14个个体的鉴定效果都较好，对亲缘关系较近的隼科鉴定效果相比较前两段更为准确。同时从猛禽各物种亲缘关系方面来看，鸮形目的草鸮和隼形目隼科先聚类后再与鸮形目鸱鸮科聚类，这说明草鸮科与隼形目的亲缘关系更为接近，与传统分类学观点相驳，与王翔等根据tRNA基因使用不同参数设置构建系统进化树，也认为草鸮科应归入隼形目（王翔等，2004）一致，但与雷霆等通过测定草鸮的12SrRNA基因研究表明的与隼形目鹰科相比，同为鸮形目的草鸮科与鸱鸮科之间的亲缘关系更近（雷霆等，2006）相悖，当然这可能与我们所分析的片段较短，序列信息较少有关。模拟实验和实验验证的结果分析表明，微型DNA barcode用于猛禽物种的分子分类鉴定是可靠的，和DNA条形码一样均可作为猛禽物种鉴定的可靠依据。目前的条形码库建设大都放在新鲜组织样本上，按照通用的标准流程轻松且廉价的获得全长barcode序列用于大量物种的鉴定，并用于生物多样性研究(Hajibabaei et al. 2005)。 本研究证实了从馆藏陈旧标本中获得的相对较小的barcode片段在物种鉴定中仍有很高的应用价值。70年代之前的博物馆干制标本大都是用砷皂作为防腐剂在脱水后涂抹于其表面，极其坚硬，近几十年来换成了硼砂皂作为防腐剂。本研究采用的标本是运用砷皂作为防腐剂干制标本，DNA提取较为困难，且其中的杂质和抑制剂很多，对后续的PCR扩增影响较大，在提取中我们尝试运用OMEGA粪便提取试剂盒中的SP2去除大量杂质和HTR去除抑制剂从而保证了后续的研究。本研究对实践中应用微型DNA barcode研究DNA损伤和降解的馆藏干制标本和福尔马林浸泡标本提供了较为有效的方法，同时也对构建覆盖地域更广，更为准确完善的条形码库具有重要意义。参考文献范京安，顾海丰，莫帮辉等.2009.DNA条形码识别：基于微型DNA条形码的果实蝇物种鉴定J.应用与环境生物学报15(2):215-219.雷霆，陈小麟.2006. 猛禽和夜鹰类的线粒体DNA序列比较和分子进化关系的研究J. 厦门大学学报(自然科学版)，45(5):156162.李湘涛.2004.中国猛禽M.北京:中国林业出版社.莫帮辉，屈莉，韩松等.2008.DNA条形码识别I：DNA条形码研究进展及应用前景J. 四川动物，27(2):303306.王翔，孙毅，袁晓东等.2004.猛禽类15种鸟类线粒体tRNA基因序列及二级结构的比较研究J，遗传学报，31(4):411419.Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. 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