卫生微生物月-食品微生物检验方法的国内外研究进展.docx

食品微生物检验技术的国内外研究进展陆杰明摘要：近30年来，随着国际食品经济和贸易的发展，全球性食品安全问题备受关注，故对食品微生物的检验技术越来越重视。本文介绍了近几年来国内外对食品微生物的检验技术，以及提出对检验方法方向的展望。关键词：食品微生物检验；分子生物学技术；免疫学；仪器化Research progress of food microbiological testing methods at home and abroadLu Jie-MingAbstract: In the past 30 years, with the development of international food economy and trade, the global food safety problem has attracted much attention. This paper introduces the research progress of food microbiological inspection methods in recent years and puts forward the prospect of testing methods.Keywords:Food microbe testing; Molecular biology technology; immunology; Instrumentation.1. 引言随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题逐渐成为各国政府、公众关注的焦点问题。食品达到细菌学的卫生条件是最终制品中不允许存在致病菌，即使存在食物中毒菌，也必须达到不损害人体健康的安全水平。由于食品微生物污染的广泛发生，严重影响人民的健康，因此食品微生物检验工作对评价食品卫生质量，保证消费者饮食卫生有着极为重要的作用，并且研究灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法，建立和完善食品安全微生物检测技术和体系越来越重要。本文将介绍近几年来国内外食品微生物检验中具有代表性的几种检验方法2.国内外食品微生物检验方法的进展2.1电阻抗法电阻抗法的原理是电阻抗法的主要原理是检测培养基中的大分子在电中性或弱离子条件下的微弱电位变化。从而在未出现菌落之前就能检测到微生物的存在1。电阻抗法一次可同时测定128份试样,操作简便、快捷,可避免人工操作造成的主观判断差异,全部结果量化并由打印机自动打出。但是电子讯号、食品配方、培养基、温度等变化都会影响检测结果,因此制作校正曲线必须在同一配方试样间进行,也就是说校正曲线的服务对象必须是单一的,该方法对食品中菌落总数测定的改进和对食品生产企业快速监测食品中细菌污染有很大的作用2。2.2分子生物学技术（1）核酸探针技术 1.以DNA为靶目标的检验中国开展的食品微生物检验项目主要包括细菌总数、大肠菌群、沙门菌、霉菌和酵母以及毒素等3。所以,有关的检测有很多是针对细菌而来的。DNA是细菌的主要遗传物质,所以设计的探针一般是目标DNA的互补序列。在设计探针时要依照待检测微生物特异的DNA序列。比如在设计检测产气荚膜梭菌的探针时,克隆的是产气荚膜梭菌的产毒基因4。致肠病的大肠杆菌则针对其致肠病的基因序列来设计。这种检验在食品微生物检测中的应用研究十分活跃,例如食品中的大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella spp)、小肠结肠炎耶尔森(Yersinia enterocoliti-ca)、产单核细李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的检测等。2.以rRNA为靶目标的检验该种检验方法常使用AccuProbe基因作为探针,其原理是利用Acridinium ester作为荧光发光物质,标记特异性单链作为探针,与待测细菌中的核糖体RNA(rRNA)互补,形成稳定的DNA:RNA杂交体。选择试剂再将未结合的多余探针破坏掉,最后通过发光仪检测标记的杂交体。翁文川等应用该方法检测食品中产单核细胞李斯特菌,结果表明,采用该基因探针方法检测食品中产单核细胞李斯特菌特异性强,需要的时间短。吴仲梁等也用AccuProbe检测食品中的产单核细胞李斯特菌,同样证明该方法具有正确、灵敏、快速、简便等优点,适于推广应用.6 （2）聚合酶链式反应(PCR)技术聚合酶链反应，是一种在体外模拟自然DNA复制过程，对特定的DNA或DNA片段进行快速扩增的方法。 PCR技术除了具有核酸分子杂交的优点如特异性强、可从基因水平进行诊断和同时检测大量样品等外，比核酸分子杂交更加敏感、更加快速和简便，且易自动化操作。PCR技术在基因诊断方面比基因探针法更敏感。PCR即聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或RNA片段的技术。这种技术被誉为近半世纪来生命科学中最伟大的发明。PCR具有如下特点：由于以碱基配对原则使引物与模板DNA特异正确结合， DNA聚合酶合成反应的忠实性和靶基因的特异性与保守性，共同决定了 PCR的高特异性；PCR具有高敏感性，因为PCR产物量是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌检测中，最小检出率可达3个细菌；简便、快速，通过使用耐高温的 TaqDNA聚 合 酶 ， 一 次 性 将 反 应 液 加 好 后 ， 在DNA扩增仪上进行变性 - 退火 - 延伸反应，一般在 24 小时完成扩增反应，扩增产物易分析，不一定使用放射性核素，无放射性污染、易推广，对标本的纯度要求低，适应范围广4。更有研究发现，将PCR技术和核酸杂交技术综合起来应用,可以增强检验的灵敏度。因为通过PCR可以将要检测的核酸扩增得很多,从而使核酸杂交的靶序列得到了增强。A Ingianni等曾报道用PCR与核酸杂交结合的办法进行了180多个样品中产单核细胞李斯特菌的检测,同时比较了直接PCR,单独的核酸分子杂交及其它相关的检测方法,表明两种方法结合相比其它方法更加快速和特异6。2.3 抗体的方法 (1)乳胶凝集反应 利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应。Au- reus Test用于食品样品中金黄色葡萄球菌的检测，该试剂盒中含有对免疫抗蛋白A IgG和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子，因细菌蛋白A和IgG结合，凝聚酶和鞭毛抗原结合，所以当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加人含乳胶粒子的试剂盒中时1 min内将产生凝集反应。该法的灵敏度和特异性均较高。(2)酶联免疫吸附法这是用于定性或定量测定特异抗原抗体的一种技术，它多采用“夹心式”设计，即用抗体包被聚苯乙烯孔捕获抗原，用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，再用一种生色酶底物通过肉眼观察或比色法记录结果。随着单克隆抗体酶联免疫技术的出现，免疫检测法的特异性有了明显的提高。2. 4仪器法 随着微生物快速检测法的不断发展，很多检验技术日趋成熟和完善，并被人们进一步开发、研制成自动或半自动微生物检测仪。(1)流式细胞术(FCM )该技术是用流式细胞仪对细胞悬液进行自动快速定量分析和分选的新技术，具有速度快、精确度高、记数细胞量大以及参数分析、全面测量细胞和分选细胞等优点。由于FCM检测到的荧光强度的强弱与DNA片段的大小成比例，根据荧光浓度的直方图就可知道细菌的DNA指纹图谱，从而确定细菌的种类。现在该技术已经能够检测纯化的DNA可达Pg级水平，在10 min内可以完成数据的收集和分析。近年来在临床实验室已经逐步用于病毒、细菌的检测、计数、鉴定等。(2)免疫磁性微球免疫磁性分离技术不但广泛用于医学的各个领域，而且在食品卫生检测方面的应用也见端倪。由于食品检样常为固液多相混合体，采用常规方法难以将少量的致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术，可以达到快速分离的目的。免疫磁性分离技术与常规检验方法相比具有显著的优点，可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物，并节省时间。(3)电阻电导检测器原理是当细菌生产繁殖时，将蛋白质、糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机酸等带电荷的小分子物质，改变培养液的导电度，这样，测量电阻和导电度的变化，就可推算出样品原来的含菌数。(4)VITEK一AMS该系统为用于微生物鉴定及药敏试验的设备，其原理是将微生物数码鉴定的方法与计算机技术结合起来，实现了从读数、编码、解码、打印结果的鉴定全过程的自动化。其特点为:鉴定细菌类型广;具有最大的准确性;鉴定时间短;高度可重复性;仪器操作方便。(5)VIDAS全自动免疫分析仪 VIDAS全自动化荧光酶标免疫测试系统的特点和优点为:全自动操作，所有样品的洗涤、结合、基质读数及报告说明等都是全自动操作;快速测定:由样品进人仪器计算，约需1一2. 5 h即可出结果及报告，容量大，可同时测定30个标本。(6)ATP生物发光法 ATP生物发光法快速，甚至可以将细菌计数时间缩短至几分钟，操作简便、灵敏度高，具有其他微生物快速检测方法不可比拟的优势，曾被称为是检测环境中微生物最方便可靠的方法。33.食品微生物的检验技术发展方向通过上面的介绍可见，各种方法各有各的优点和不足。但随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。特别是近年来兴起的基因芯片技术及自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法，一些新的微生物检验方法和手段将不断涌现。现更有联合几种检测技术来提高灵敏度或特异度的联合试验。4.结语随着近几年的新技术、新方法的涌现，食品微生物检验技术将向高效率、高标准、高精度和高灵敏度的方向发展，必定对人类公共卫生、食品安全、营养健康与疾病预防等做出巨大贡献。 参考文献：1 刘秀梅.我国食品卫生微生物学30年来的热点研究及主要进展J.中国食品卫生杂志,2009，21（4）:289-295.2 赖蔚苳，黄吉成，戴昌芳等. 电阻抗法快速测定食品中菌落总数的应用研究J.中国食品卫生杂志,2001,13（4）:13-15.3 王云国,李怀燕.食品微生物检验内容及检测技术J.粮油食品科技,2010,18(3):40-43.4 张洁梅.食品微生物检验技术的研究进展J.现代食品科技,20