细胞凋亡的生物学意义及其相关基因.doc

第一节 细胞凋亡的生物学意义及其相关基因对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限。癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞细胞的增殖能力与供体年龄有关。物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系。一、 细胞衰老二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的。决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境；是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老。在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; 二、衰老细胞结构的变化1.n细胞核的变化：n 体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化。n 2. 内质网的变化：n衰老动物内质网成分弥散性地分散于核 周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了。n 3.线粒体的变化： n 通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大；致密体的生成：脂褐质，老年色素等。n 4.膜系统的变化：n 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化（减少）三、细胞衰老的分子机理氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS-O2-， OH- ， H2O2 ），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 q 端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的 “有丝分裂钟”学说（Harley,1990） 。q rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环的积累，导致细胞衰老。q 沉默信息调节蛋白复合物与衰老：复合物存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。.细胞衰老的分子机理：1.SGS1基因和WRN基因与衰老： SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突变引发早老症. q 2.发育程序与衰老:q 线粒体DNA与衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关(一)细胞死亡的方式死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞死亡的方式通常有3种：细胞坏死（necrosis）细胞凋亡（apoptosis）细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） 1.细胞坏死q 影响因素:化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）、生物因素（如病原体）、坏死细胞的形态改变。病理过程 酶性消化：参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis） 蛋白变性 坏死细胞的形态改变1）初期：胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。q 2）中期：随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，导致细胞结构完全消失。q 3）末期：细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。 细胞死亡现象也是生命新陈代谢的固有本质，例如胚胎发育、正常组织更新，以及在增殖淋巴细胞群体中选择适当的克隆，这种细胞生理性死亡是种系发育史中早就存在的，有利于动物发育中的许多生命功能。2.细胞凋亡1972年Keer根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。死亡是生物体普遍存在的现象并非每个细胞都能走到终点，相当一部分细胞，甚至绝大部分细胞都会在中途凋亡。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：早期的细胞核呈波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；中期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；晚期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。凋亡细胞的主要特征染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止。核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状。凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。凋亡的意义q 由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。生物适应环境的需要，使各种细胞的生存时限达到平衡。细胞凋亡与细胞坏死的区别区别点 细胞凋亡 细胞坏死起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解细胞体积 固缩变小 肿胀变大凋亡小体 有 无DNA 呈梯状 呈涂抹状蛋白合成 有 无调节过程 受基因调控 被动进行炎症反应 无 有3.细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）细胞程序性死亡是胚胎正常发育所必需的。PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用，但两者实质上是有差异的。q PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分。凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不同的受到基因控制的细胞死亡形式q PCD的最终结果是细胞凋亡，细胞凋亡并非都是程序化的。二、细胞凋亡的相关基因（一）Fas受体是凋亡的主要引发剂1、Fas受体基因 定位在10q23，全长25kb，有9个外显子和8个内含子。表达产物是跨膜蛋白，重要分布在外周血中活化的T、B细胞。2、 Fas配体基因 定位在1q23，全长8kb，包含4个外显子和3个内含子。表达类膜蛋白。3、作用Fas受体与Fas配体的相互作用启动了细胞凋亡的通路。当载有Fas配体的细胞相互作用时，载有Fas受体的细胞将会发生凋亡Fas的聚集过程q Fas能形成同源三聚体，在与配体作用前装配成更大的聚合体，FasL作用Fas时，一个聚集过程能使Fas激活通路的下游Fas介导的细胞凋亡途径。 4、Fas的特点 胞外区：三个富含半胱氨酸的胞内区：死亡结构域（Death domain，DD）FasL与Fas结合，使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD的DD区结合。FADD的N端DED区（death effector domain）就能与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合形成DISC (death-inducing signaling complex )，引起caspase-8、10通过自身剪激活，启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。5、Fas/FasL系统在免疫系统中的意义q 参与免疫调节：活化成熟的外周T细胞主要通过Fas/FasL系统介导的细胞凋亡清除与自身抗原有交叉反应的克隆和由自身抗原激活的细胞克隆 以限制T细胞克隆的无限增殖，防止对自身组织的损伤，即产生外周免疫耐受。淋巴细胞凋亡异常导致的免疫耐受失控，是自身免疫性疾病的主要病因 细胞毒T细胞（CTL） 通过FasL诱导靶细胞凋亡 某些肿瘤细胞也可以通过这一途径诱导淋巴细胞凋亡，从而逃脱免疫监控。（二）Caspase家族 半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。特点：酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease） 都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。caspase的抑制因子IAPs（inhibitors of apoptosis proteins）：属于一个庞大的蛋白家族，能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。（三）Apaf-1 Apaf-1称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1）在线虫中的同源物为ced-4。在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1结构特点CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9 ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c的结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体，激活caspase-3，启动caspase级联反应。（四）Bcl-2家族q Bcl-2为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。功能相当于线虫中的ced-9。已发现至少19个同源物，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），有一个羧端跨膜结构域。BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域（五）p53抑癌基因功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，（六）c-myc促进细胞增殖、抑制分化；能激活那些控制细胞增殖的基因；激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡 。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡 作用：基因产物都位于细胞核内，可与某些特定DNA相结合，影响DNA复制的起动过程或对转录进行调控，从而实现其调节细胞生长、增殖、分化的目的。第二节 细胞凋亡信号的传递一、经典的信号传递途径（一）酶偶联受体介导的信号传递与细胞凋亡1、受体活化蛋白激酶是细胞凋亡信号传递途径中重要的酶类，其激活需要受体的活化。生长因子类受体活化结构特点:胞外区(配基结合区)、跨膜区、胞质区。2.胞内信号级联反应级联反应的分子基础是参与反应的受体以及一系列下游激酶或蛋白分子中的功能区。SH2:结构域介导信号分子与含酪氨酸磷酸化的蛋白分子结合；SH3:介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子结合；PH:接受多种信号并将其传递至不同效应分子；PTB:特异识别蛋白分子中Asn-Pro-X-Tyr序列,并与磷酸化的酪氨酸结合3.酶偶联受体介导的信号传递与细胞凋亡二、G蛋白偶联受体介导的信号传递与细胞凋亡第三节 细胞凋亡与人类疾病一、肿瘤与细胞凋亡二、系统性红斑狼疮（SLE）与细胞凋亡SLE的免疫学特征：自身抗体的产生，抗DNA抗体，抗核糖体抗体，抗组蛋白抗体。第四节 细胞凋亡的检测技术一、细胞凋亡的形态学检测技术（一）非染色光学显微镜检测技术1、普通光学显微镜法坏死细胞：体积增大、细胞膜损害或裂解、网状的染色体。细胞凋亡：体积变小、变形、细胞膜完整、发泡、凋亡小体。2、电子显微镜观察法凋亡细胞：体积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结成块、晚期凋亡小体（二）染色法光学显微镜检测技术染色方法：苏木素（HE）染色法、姬姆萨染色法、甲基绿-派诺宁染色法细胞核 ：蓝色胞浆：淡红色染色质：致密浓缩凋亡小体（三）荧光染料染色-流式细胞测定碘化丙啶（PI）：只能使坏死细胞染色，显示红色。双苯并咪唑（hoechst33342）：可穿越细胞膜对活细胞和凋亡细胞的DNA染色显示蓝色。1、双苯并咪唑染料吸收法凋亡细胞蓝色荧光明显强于活细胞和非凋亡细胞光，散射能力降低，坏死细胞PI复染呈现红色荧光。2、碘化丙啶（PI）排斥分析法先用PI染色、再用Ho染色，坏死细胞呈现红色荧光，活细胞Ho蓝色荧光最强。凋亡早期蓝色荧光变弱，弱红色荧光，凋