SOD、MDA、GSH.doc

改良的盐酸羟胺法测生物样品SOD活性一 SOD（T-SOD）活力测定：原理：羟胺在有氧环境下发生自氧化可产生超氧阴离子，产生的超氧阴离子可由NBT还原率而检测，在SOD存在下，超氧阴离子被分解，NBT还原被抑制。因此，用比色法测定NBT还原产物可以间接反映SOD的酶活力。仪器：可见光分光光度计试剂：75mM Na2CO3 /NaHCO3缓冲液（pH=10.2，含0.15mM EDTA-Na2）5mM NH2OHHCl0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml甲酸步骤：1. 用1:5组织匀浆（血清可直接取样），3000rpm离心30min，取上清20ul稀释至0.1ml2. 按顺序加入如下试剂：75mM Na2CO3 /NaHCO3缓冲液 2.0ml5mM NH2OHHCl 0.5ml0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml3. 立即计时，于37恒温水浴10min（避光）。4. 2.0ml甲酸终止反应。5. E560nM比色，记录OD值。计算结果：酶单位表示：在本实验条件下，抑制率达50%所对应的提取液SOD含量即一个SOD单位（U）。可用每g蛋白（U/g protein）表示。二 Mn-SOD活性测定：基于氰化物抑制CuZn-SOD非Mn-SOD活性的原理，在上述缓冲液中加入KCN，使最终反应体系中的KCN浓度达到2mM，即将缓冲液配成含3mM的KCN。37孵育45分钟，以抑制CuZn-SOD。其余操作、步骤、计算方法同上。三 CuZn-SOD酶活力 = T-SOD酶活力单位 Mn-SOD酶活力注意事项：1) 对照组（非酶管）取样品同体积的三蒸水，其余步骤同样品。2) 若测血中SOD，可取血清20ul，其余地操作步骤同上。来自：第四军医大学硕士王建宏学位论文诊断剂量超声对鼠胚胎和人绒毛脂质过氧化及超微结构的影响。导师：钱蕴秋。单位及专业：西京医院超声诊断科，超声诊断学。1991.5-1992.6。参考秦绪军、常耀明硕士论文原始参考文献：1、 Kono Y. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys. 1978 Feb; 186(1):189-95. 或者Yasuhisa Kono. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Anchives of Biochemistry and Biophysics. 1978 Feb; 186(1):189-95.2、 Yisun et al. Free Rad Res Comms 1988; 4:299-309.刘树元制作2003-5-7荧光法测定血清脂质过氧化产物（MDA）原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（简称MDA），可与硫代巴比妥酸（简称TBA）缩合，形成红色产物。此红色物质在波长532nm有极大吸收峰，可用分光光度法进行定量测定。若以515nm为激发光，则在553nm有最强荧光强度，故可用荧光法进行微量测定。灵敏度高，再现性好，试样用量少，是该方法的优点。仪器：荧光分光光度计试剂：1) MDA标准储备液（1mmol/L 四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：准确称取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至100ml，放4冰箱，可保存三个月。2) MDA标准应用液（1mol/L）：准确量取标准储备液0.1ml于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，用时再准确稀释（现用现配）。3) 1/24mol/L H2SO4 4) 10% 磷钨酸溶液5) 0.67 硫代巴比妥酸（TBA）：新鲜配制（溶于水与冰醋酸等体积混合液）。6) 正丁醇（水饱和）步骤：血清样品 50l1/24mol/L H2SO4 4.0ml10%磷钨酸 500l混匀放置5min 2000rpm离心10分钟弃上清 ，空在滤纸上1/24mol/L H2SO4 2.0ml10%磷钨酸 300l混匀放置5min， 2000rpm离心5分钟弃上清 ，空在滤纸上样品管 空白管 标准管双蒸水 1.0ml(震1分钟) 1.0ml /标准品 / / 1/0.5/0.25/0.125/0.0625各1.0ml0.67TBA 1.0ml 1.0ml 1.0ml振荡、混匀 100准确水浴1h取出流水冷却至室温正丁醇（水饱和） 4.0ml振荡抽提1分钟，2000rpm离心5分钟取上清（正丁醇层）约3.0ml(若出现混浊，可加一滴无水乙醇)测定荧光强度，激发光（515nm）发射光（553nm）计算结果：丙二醛浓度=0.51.00/0.051.05/0.5f/F = 21f/F nmol/ml血液f：样品溶液的荧光强度F：标准溶液的荧光强度注意事项：弃上清时，不要回手。改良荧光法测定还原型谷胱甘肽原理：OPT在PH为8.0的时候与还原型谷胱甘肽合成GSH-OPT，在一定的激发波长和发射波长下进行荧光测定，从而对GSH进行定量。仪器：荧光分光光度计试剂：1）0.1%邻苯二甲醛（OPT）溶液：临用前称取OPT10mg溶于10ml甲醇，混匀。2）0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（含5mmol/L EDTA）：称取Na2HPO4.12H2O 35.814g、 EDTA-Na2 1.861g，用蒸馏水溶解并定容至1L，调节pH至8.3。3）1：4甲醛溶液：1体积甲醛加4体积磷酸盐缓冲液混合。4）GSH标准储存液：新鲜配制，将GSH配成1mg/ml水溶液5）GSH标准应用液：新鲜配制，取标准储备液用水稀释成0.5ug/ml的溶液。6）10%的三氯醋酸溶液步骤：试剂（ml） 测定管 标准管 空白待测样品 0.2 应用液 0.2 双蒸水 0.210%的三氯醋酸 0.2 0.2 0.2摇匀，室温静置10 min，5000g离心10min,，吸上清上清液 0.1 0.1 0.1甲醛 0.1 0.1 0.1摇匀，静置5min0.1mol/L缓冲液 3.6 3.6 3.6摇匀，立即加入OPT溶液0.2ml，摇匀，静置40min测定：激发波长350nm, 发射波长425nm，空白调0，读取荧光读数。计算结果：测定管荧光读数标准管荧光读数GSH 浓度(umol/L)= 1000307.3注意事项：1）GSH的浓度是在2.5ug/ml内，线性关系良好，最低检出限为25ng/ml。2）本法测定过程中，加入OPT后，40min荧光值达最高读数，在其后20min内稳定。3）可用偏磷酸沉淀剂代替10%的三氯醋酸，但须在40C下完全沉淀。4）用三氯醋酸沉淀蛋白，为达到最佳PH值8.0，故使用pH8.3的磷酸盐缓冲液。5）甲醛的作用是降低非特异性干扰。 荧光法测定氧化型谷胱甘肽原理：OPT在PH为12时，与GSSG特异地结合成GSSG-OPT，在一定的激发波长和发射波长下可进行荧光测定，从而对GSSG定量。N-乙基马来酰亚胺（NEM）能与GSH络合，并防止GSH转变为GSSG，可用来消除GSH转变为GSSG对GSSG含量测定结果的影响。仪器：荧光分光光度计试剂：1）25%偏磷酸 2）1mg/mlOPT：用甲醇配制。 3）0.04mol/L NEM水溶液 4）0.1mol/L NaOH 5）GSSG标准液：0.5ug/ml，用0.1mol/LNaOH配制。步骤：1）样品制备：采集全血，加入0.06体积的SBE抗凝，12000g离心1.5min，分离上清，冰浴待测。或取组织0.5g，加入7.5ml磷酸钠-EDTA缓冲液、25%偏磷酸溶液2ml，制成5%的匀浆。室温下6500g离心15分钟，分离上清液，置冰浴中待测。 2）吸取0.5ml上清，加入0.2ml NEM溶液，室温静置30min。 3）加入0.1mol/L NaOH溶液4.3ml，混匀待测。 4）加样检测：试剂（ml） 0 1 2 3 4 5 样品管GSSG标准液 0 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 /待测样品液 / / / / / / 0.1NaOH 2.0 1.9 1.5 1.0 0.5 0 1.9OPT-甲醇液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1GSSG含量（g） 0 0.05 0.25 0.5 0.75 1.0将各管混匀，室温下静置30min选择激发波长337.8nm，发射波长421.6nm，以标准曲线中的0管作对照，测定各管荧光强度。计算结果：以GSSG标准液的浓度为坐标横轴，以其对应的荧光强度值为坐标纵轴，绘制标准曲线，求直线回归方程。将样品管的荧光测定值代入方程，可直接求出待测样品中的GSSG的含量。注意事项：1）OPT可与GSH在PH8.0时结合，故可测定GSH含量，用0.1M磷酸钠0.005M EDTA缓冲液(pH8.0)替换NaOH，同时样品不用NEM处理。2）GSSG及GSH在室温下形成荧光物质需一定时间，20min尚不能稳定，25min反应基本完全，2h内稳定不变，故选择30min。3）本法的特点是可同时测定GSH与GSSG。分光光度法测定谷胱甘肽过氧化物酶的活力原理：谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）可促进氢过氧化物与还原型谷胱甘肽的反应。谷胱甘肽过氧化物酶的活力，可以其酶促反应的速度来表示。另外，利用氧化型谷胱甘肽和辅酶2在谷胱甘肽还原酶作用下的反应，测定辅酶2的减少，亦可求出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。测定酶促反应中过氧化物或还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力，GSHPX ROOH+2GSH ROH+GSSG+H2O H2O2+2GSH 2H2O+GSSGGSSG+2NADPH NADP+GSH仪器：可见光分光光度计试剂：1）叠氮化纳磷酸缓冲液（PH7.0）：NaN3 0.065g、EDTA-Na2 11.6g、Na2HPO4.12H2O 8.74g、 NaH2PO4.2H2O 2.43g，以双蒸水溶解，稀释至100ml，再以NaOH调节pH至7.0，4保存。2）1.0mmol/L GSH溶液：须当日配制。称取GSH 3.07mg，以叠氮化纳磷酸缓冲液溶解并稀释至10.0ml。3）1.25-1.50mmol/L的H2O2溶液：须当日配制。吸取30% H2O2 13ul，以蒸馏水稀释至100ml。4）偏磷酸沉淀液：含1.67%偏磷酸、0.05% EDTA及28%NaCl。称取适量试剂后用三蒸水溶解，可微微加热促溶，充分溶解后趁热过滤。5）0.32mol/L的磷酸氢二钠溶液6）DTNB显色液：称取0.04g DTNB、柠檬酸纳1.0g溶于蒸馏水中并稀释至100ml，盛于棕色瓶4可保存一个月。步骤： 1）GSH标准曲线的制定(ml)：10ml的容量瓶中试剂（ml） 1 2 3 4 5 6GSH液 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00偏磷酸沉淀液 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0GSH系列（mol/L）0 20 40 60 80 100标准液系列 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0磷酸氢二钠 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5DNTB溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.55min内422nm比色，以蒸馏水调02）全血GPX的测定(ml)：样品制作：采集全血50ul，蒸馏水稀释到2.0ml酶促反应（样品管） 非酶促反应（非酶管） 空白管GSH液0.4ml GSH液0.4ml /血样稀释液0.4ml 蒸馏水0.4ml /37水浴5min 37水浴5min /H2O2（37预温）0.2ml H2O2（37预温）0.2ml /偏磷酸沉淀液4.0ml 偏磷酸沉淀液4.0ml 显色反应(调0)混匀后，3000rpm离心10min上清2.0ml 上清2.0ml 蒸馏水0.4ml 偏磷酸1.6ml磷酸二氢钠2.5ml 磷酸二氢钠2.5ml 磷酸二氢钠2.5mlDTNB 0.5ml DTNB 0.5ml DTNB 0.5ml422nm5min内读取光密度计算结果：Log(非OD空OD)log(样OD空OD)3min0.004mlGPX= 谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定DTNB直接显示法一原理 测定酶促反应中GSH的消耗量，则可求出酶的活力。（注意最后计算时，必须扣除非酶促反应所引起的GSH减少部分。）GSH-Px2GSH+H2O2 GSSG+2H2OGSH量的测定：GSH+DTNB 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子 该产物呈较稳定的黄色，测定其在422nm波长的光吸收值，可计算出GSH的量，从而可反映并计算出GSH-Px的活性。二试剂与仪器1.试剂 1）叠氮化纳磷酸缓冲液（PH7.0）2）1.0mmol/LGSH溶液(当日配制)3）1.25-1.50mmol/L的H2O2溶液（当日配制)4）偏磷酸沉淀液5）0.32mol/L的磷酸氢二钠溶液6）DTNB显色液2.仪器 可见光分光光度计 离心机三操作步骤 GSH标准曲线的制作 1 2 3 4 5 61mmol/L GSH （ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 偏磷酸沉淀液 （ml） 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 蒸馏水 （ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0各取出2.0ml置入新管 0.32mol/L Na2HPO4 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 DT