壳寡糖作为基因载体的应用进展.doc

壳寡糖作为基因载体的应用进展 摘要 壳寡糖是是由N-乙酞氨基葡萄糖聚合而成的多糖，它可以通过甲壳素的脱乙酰产物壳聚糖降解而获得。如今研究壳寡糖的重点主要在如何修饰壳寡糖，因为不少研究都发现修饰后的壳寡糖在运送药物进入细胞、以及体内的释放的方面都具有明显的优势。关键词：壳寡糖，载体，目的基因，修饰1、引言基因治疗是目前最有前景、最受瞩目的治疗方法之一，它所具有的高效、靶向、副作用小等优点，极大地吸引了众多研究者的注意，使得他它在短时间内发展迅猛，给医学界带去了新的曙光。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。通常我们所说的基因治疗是指将遗传物质（DNA或RNA）导入患者的细胞中，以达到治疗疾病的目的。载体作为将目的基因导入细胞的工具，在基因治疗中占有重要一环，是基因治疗研究的重点之一。一般基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有效率高的优点，且研究较早，在基因治疗领域应用广泛，目前所使用的绝大多数是病毒载体。但是，病毒载体存在局限性，它的导向性差，可能诱导机体产生某种程度的免疫反应，存在潜在致瘤性1常用的病毒载体包括逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体和疱疹病毒载体等。相比之下，非病毒载体具有不受基因片段大小的限制，无传染性，靶向性较高等优点，成为继病毒载体后备受关注的新型载体。现如今常见的非病毒载体有脂质体、壳聚糖、纳米颗粒载体等。脂质体载体是利用人造双层磷脂质，包装 DNA后形成的脂质体DNA复合物，是应用最多的非病毒介导的基因转移系统。壳聚糖纳米粒具有靶向、缓释、增加药物吸收、提高药物稳定性等作用，其生物膜的黏着性高，可通过肠Peyers斑吸收而提高药物生物利用度2，在药物新剂型的研究和开发中得到了广泛的应用。而纳米颗粒载体又分为许多种，包括无机类纳米颗粒和天然高分子纳米颗粒。无机类纳米颗粒如硅、铁氧化物、碳纳米管、磷酸钙、羟基磷灰石、金属纳米粒子等。其转染效率虽低于病毒载体，但由于其具有无免疫原性，能免受病原菌的侵袭、低毒、装载容量大、稳定性高、易于储存、制备容易等优势而引起广泛关注。天然高分子纳米颗粒包括壳聚糖纳米颗粒，淀粉纳米颗粒，明胶纳米颗粒等，具有生物相容性好、结构稳定、结构和大小容易控制、可进行表面修饰而具有靶向性等优点，具有极强的竞争力。2、壳寡糖简介壳寡糖（又称寡聚氨基葡萄糖，Chitosan oligosaccharide，COS）是由N-乙酞氨基葡萄糖聚合而成的多糖，它可以通过甲壳素的脱乙酰产物壳聚糖降解而获得。甲壳素在地球上的量,仅次于纤维素，广泛存在于蟹壳、虾壳的甲壳和一些真菌类如曲霉菌、毛霉菌等的细胞壁中3，是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖。它还具有水溶性好,安全无毒、易被动物体吸收等优点，因此，它在很多方面都具有良好的应用价值4。壳寡糖有抑制肿瘤的功用。近几年来，国内外学者对壳寡糖的抗肿瘤作用进行了较多的研究，目前普遍认为，壳寡糖的抗肿瘤作用与其自身的正电性、相对分子质量（Mr）、脱乙酰度和化学修饰有关6。刘莹等6用不同浓度的壳寡糖作用Lovo细胞，发现高浓度的壳寡糖对Lovo细胞有明显抑制作用，而低浓度壳寡糖的抑制作用不明显。 壳寡糖有降血脂的功用。早在1988年就有人发现壳寡糖有清除血液中胆固醇的作用。胡迎春等将壳寡糖和辛代化汀分别让患有高脂症的新西兰家兔服用，发现壳寡糖具有一定的降血脂作用。Liao等7在60名志愿者中进行的实验，观察发现服用水溶性壳聚糖的实验组总胆固醇下降了7. 5 % ,服用水不溶性壳聚糖的实验组总胆固醇下降了8. 9 % 。壳寡糖有抗植物病毒的功用。商文静8等用中科6号壳寡糖喷洒在烟草叶面，证明壳寡糖具有诱导植物抗病毒的特性。Takezawa9发现壳寡糖可以诱导ccd21 基因的mRNA 迅速增加,而ccd21 基因编码一个14kD 的Ca2 + 结合蛋白。这一结果证明壳寡糖诱导的植物抗性有钙信使途径的参与,可引起离子流的改变，而钙信使系统参与壳寡糖对棉花细胞的诱抗作用,这也说明壳寡糖与植物抗病性有关。3、壳寡糖作为基因载体的应用进展 壳聚糖与壳寡糖在近几年来备受关注，因为其含有游离氨基，其氮原子上还有一对未结合的电子，使氨基呈弱碱性，能结合一个氢离子，从而成为带正电荷的电解质。研究证实壳聚糖具有生物黏附性和多种生物活性，它能与活体组织相容，不会引起过敏反应和排斥现象，其被体内的溶菌酶、胃蛋白酶降解后，降解产物能完全地被人体吸收，无毒、无副作用，比较适于作为缓控释辅料1011。壳聚糖包封药物后，可使其释放减慢、疗效延长，毒副作用降低，利用壳聚糖制备缓释、控释制剂已成为近年来新剂型研究的热点12。从载体递送基因的释放角度看，壳聚糖DNA复合物的粒径大小尤为重要，尺寸的变化 将严重影响复合物在体内的循环时间、靶向细胞的 进入以及在体内的效用13。一般情况下，纳米粒子粒径在 100nm以下能 够很好的保证细胞对粒子的内吞14。但常用的壳聚糖分子量大、粘度高,无法在生理pH 条件下溶解15，再加上消化道内水解糖苷降解的壳聚糖酶比较缺乏,导致作为药物载体组成部分的壳聚糖分子在人体消化道吸收的困难。因此，研究人员把注意转移到壳寡糖这一新型载体上。壳寡糖分子量较小，更容易进入细胞，且仍具有壳聚糖的一切优点。钱君律13等用壳寡糖与质粒DNA分别在50的温浴预热一定时间，再将纳米壳寡糖加入1.5mL EP管中与质粒 DNA溶液以一定体积比快速均匀地漩涡30s，室温放置 lh后，得到壳寡糖DNA复合物纳米粒。通过在OD260处测吸光率表明，壳寡糖DNA复合物纳米粒在37培养96h后仍有吸光率，而此时裸DNA已经没有吸收了，者说明壳寡糖DNA复合物纳米粒稳定性较强。他们还证明壳寡糖DNA复合物纳米粒能够有效的保护DNA不受酶的攻击。万丽卿16等将FITC与壳寡糖偶联，制成在生理 pH 环境下可以溶解的壳寡糖的FITC标记物（FITC-CSO），并经实验发现其细胞毒性明显低于分子量较大的壳聚糖。在接下来的A549 细胞的摄取研究表明，壳寡糖分子可以被细胞所摄取，由壳寡糖分子组成的纳米粒，其细胞摄取作用明显高于等浓度的壳寡糖分子。 Yong-Zhong Du等人用壳寡糖和二氯甲烷分别作为水相和油相，经超声波处理后制成O/W乳液，再让紫杉醇与O/W乳液发生加成聚合反应，制成装载紫杉醇的壳寡糖。他们的实验发现，壳寡糖可很好的携带紫杉醇进入细胞，携带的效率与加入O/W乳液中的交联物成正比，且药物的的释放率越低，因此药效持久17。壳寡糖的表面可以被不同化学的集团修饰，而修饰后的壳寡糖的转染效率有所提高，在保护目的基因、增强靶向性等方面也有改观。用硬脂酸对壳寡糖进修饰研究的比较深入。李樱红18等用碳二亚胺嫁接壳寡糖与硬脂酸，制成壳寡糖硬脂酸接枝物纳米粒（COS-SA），用它包埋促黄体生成素释放激素，然后研究了接枝物的体外释放，实验证明：随着pH值的下降，载药纳米粒的粒径减少，Zetr电位上升，药物包封率提高。载药纳米粒的体外释放符合Higuchi方程，释放速率则随释放介质pH的下降而延缓。Fu-Qiang Hu19等也做了类似实验。他们用酶降解壳聚糖制成壳寡糖，在特定环境下使壳寡糖的氨基与硬脂酸的羧基反应结合成壳寡糖硬脂酸接枝物，进而研究壳寡糖和COS-SA针对A549细胞的转染效率。他发现与脂质体比较下，壳寡糖和COS-SA只是轻微的影响细胞的活性，用含10%小牛血清的培养基培养A549细胞，然后加入载体与目的基因，发现以COS-SA为载体的细胞中目的基因表达率增加，这说明COS-SA更加适合作为体内基因转染的载体。他们还检验了硬脂酸对壳寡糖的替换率对COS-SA性质的影响，发现在一紫杉醇为模型药物时，替换率越高，COS-SA微粒的溶解率越强，药物从微粒中释放的越慢，因此药效也就越持久20。Fu-Qiang Hu等还更深一步的研究了壳寡糖硬脂酸接枝物的体内释放效果。他将戊二醛加入1.0mg/mL的COS-SA溶液中，在室温下搅拌，合成了交联的壳寡糖硬脂酸接枝物微粒。接着他们比较了COS-SA和交联COS-SA之间的性质，发现交联的COS-SA并没有明显改变COS-SA的性质。一定量的阿霉素与COS-SA共轭物注射到裸鼠中，能够对肿瘤细胞产生抑制作用，但用同样计量的阿霉素直接处理裸鼠，裸鼠死亡，证明用COS-SA的包裹阿霉素可改良裸鼠对阿霉素的抗性21。但交联COS-SA能够更好的保护阿霉素在进入靶细胞，而不容易在进入的过程中就因载体破裂而释放，也因此针对肿瘤细胞具有更强的药效，特别是对阿霉素不敏感的肿瘤22。用其他一些集团修饰壳寡糖的实验也引起了许多学者的注意。 Su Young Chae23等先激活脱氧胆酸（DOCA）的羧基，让它与壳寡糖的氨基部分发生反应，从而合成壳寡糖-脱氧胆酸共轭复合物（COSD），COSD具有两亲性，在水中易形成壳-核结构。他发现，无论是在含有或是不含有10%小牛血清的培养基条件下，DOCA的转染效率均是脂质体的20100倍，且比没有修饰的壳寡糖转染效率高，只是DOSD的最佳转染环境比生理pH要稍微低些。Yong-Zhong Du24等合成亚油酸-壳寡糖接枝物，并以阿霉素为例，用透析法合成装载阿霉素的亚油酸-壳寡糖接枝物。他发现装载阿霉素的亚油酸-壳寡糖接枝物颗粒的药物释放能力随着亚油酸-壳寡糖接枝物接枝率的增加而降低，药物释放速率随着阿霉素的装载而加快。M.Thanou25等在碱性条件下将1g壳寡糖加入40mlN-甲基吡咯烷酮中，60水浴，再加入6ml碘甲烷，进而经一系列后续处理制成季铵化的壳寡糖。实验中发现季铵化的壳寡糖能够有效的浓缩DNA并形成200500nm的复合物，此复合物只对COSt-1细胞的转染效率要比脂质体-DNA复合物的转染效率高。总的来说，经修饰后的壳寡糖不论在转染效率和保护目的基因、药物释放的时间等方面都具有优势以及进一步改进的潜能。4、 壳寡糖的应用前景壳寡糖作为基因载体较其它材料制作的微球有明显的优势。首先，壳寡糖等聚阳离子载体要比同为非病毒载体的脂质体更加稳定26,它的表面有丰富的功能基团，可吸附或包裹目的基因；其次，它可以被不同化学的集团修饰，在提高转染效率上有很大潜能；同时，它来源广泛，价格低廉，是作为载体原料的理想选择。它在基因载体领域所具有的巨大潜能值得广大学者继续深入的研究。我们可以推论，壳寡糖在基因治疗的领域必定会发挥重要的作用。 参考文献1全贵红,金东洙.基因治疗载体的研究现状J.延边大学医学学报,2008 ,31( 2):147-150.2Behrens I,Pena A I,A lonso M J,et al.Comparative up take studies of bioadhensive and non-bioadhensive nanoparticles in human intestinal cell lines and rats: the effect of mucus on particle adsorp tion and transport J . 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