基因工程操作步骤课件.ppt

1 2基因工程的基本操作程序 知识回顾 基因工程基本操作的四个步骤 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 有了目的基因 我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可进行遗传 表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达 才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达 一 目的基因的获取 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 不编码蛋白质 编码蛋白质 连续不间断 编码区 非编码区 调控遗传信息表达 上游有RNA聚合酶结合位点 基因结构 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 编码区 非编码区 外显子 能编码蛋白质的序列内含子 不能编码蛋白质的序列 有调控作用 上游有RNA聚合酶结合位点 启动子 与RNA聚合酶结合位点 基因结构 1 从基因文库中获取目的基因 1 基因文库的概念 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 2 基因文库的种类 基因组文库 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 只包含了一种生物的部分基因 如 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 与运载体连接导入 基因组文库 cDNA 受体菌群体 与运载体连接导入 cDNA文库 某种生物某个时期的mRNA 真核细胞的cDNA的获取 编码区 非编码区 非编码区 DNA聚合酶 剪接有关的酶 RNA聚合酶 mRNA前体 mRNA 单链DNA cDNA 逆转录酶 转录 剪接 逆转录 复制 启动子 终止子 基因 不含非编码序列 即不含非编码区和内含子 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信息 例如 根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因 2 利用PCR技术扩增目的基因 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 PCR技术的操作过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 d 重复a b c步骤 每重复一次 目的基因增加 倍 一 变性 1 目的基因DNA受热变性 解链 2 引物与单链互补结合 3 合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸 过程 PCR技术的操作过程 PCR反应体系中目的基因成指数 2n 形式扩增 PCR技术扩增与DNA复制的比较 碱基互补配对原则 碱基互补配对原则 四种脱氧核苷酸 模板 酶 ATP 四种脱氧核苷酸 模板 酶 引物 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化解旋 半保留复制 边解旋变复制 半保留复制 全解旋再复制 体外复制 主要在细胞核内 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 解旋酶 DNA连接酶等 PCR技术扩增过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 复性 55 60 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 3 人工合成法 在基因较小 核苷酸序列已知的情况下 可以利用DNA合成仪人工合成 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 基因的核苷酸序列 目的基因 化学合成 推测 推测 思考 化学法合成的目的基因含内含子 启动子和终止子吗 人工合成法 真核生物 反转录法 目的基因的信使RNA 目的基因 化学合成法 肽链氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 推测 推测 单链DNA 合成 课堂小结 目的基因的获取 1 从基因文库中获取 2 利用PCR技术扩增 3 人工合成 种类 基因组文库 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 只包含了一种生物的部分基因 如 cDNA文库 二 基因表达载体的构建 基因工程的核心 二 基因表达载体的构建 核心 1 用一定的 切割质粒 使其出现一个切口 露出 2 用 切断目的基因 使其产生 3 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 1 过程 23 可编辑 基因表达载体的构建 核心 质粒 DNA分子 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种限制酶 目的基因与运载体的结合过程 实际上是不同来源的基因重组的过程 表达载体 过程 基因表达载体的构建 基因工程的核心 1 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 2 基因表达载体的组成 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因 它们各自的作用是什么 启动子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片断 它是RNA聚合酶识别和结合的部位 有了它才能驱动基因转录出mRNA 最终获得蛋白质终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将有目的基因的细胞筛选出来 3 基因表达载体的组成 它们有什么作用 a 目的基因 b 启动子 c 终止子 d 标记基因 位于基因的首端 是mRNA结合位点 位于基因的末端 终止转录 检测目的基因是否导入受体细胞 三 将目的基因导入受体细胞 1 目的基因导入植物细胞的方法 1 农杆菌转化法 农杆菌特点 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 原理 Ti质粒上的T DNA可以转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 三 目的基因导入受体细胞 构建基因表达载体 转入 农杆菌 植物细胞 导入 稳定维持和表达 过程 1 目的基因导入植物细胞的方法 2 基因枪法 目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法 利用压缩气体产生的动力 将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中 使目的基因与其整合并表达的方法 钨粉粒子和金粉粒子 粒子的直径一般在0 6 4um 适用 单子叶植物 1 目的基因导入植物细胞的方法 3 花粉管通道法 将目的基因导入植物细胞 操作方法 在植物花受粉后 花粉形成花粉管还末愈合前期 剪去柱头 然后 滴入DNA 含的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点 十分简便经济 例 转基因抗虫棉 2 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射法 程序 目的基因表达载体提纯取卵 受精卵 显微注射受精卵新性状动物 3 将目的基因导入微生物细胞 微生物作受体细胞原因 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 常用菌 大肠杆菌 常用法 Ca2 处理获得感受态细胞 过程 Ca2 处理大肠杆菌 感受态细胞 感受态细胞吸收DNA 表达载体与感受态细胞混合 小结 将目的基因导入受体细胞 四 目的基因的检测与鉴定 导入过程完成后 全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗 1 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少 2 目的基因进入受体细胞后 是否都能稳定维持和表达 不一定 需要检测 1 鉴定 分子水平的鉴定 转基因生物的DNA 探针 15N 15N 14N 14N 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 基因探针 放射性同位素等标记的DNA分子 方法 DNA分子杂交技术 变性 变性 1 鉴定 分子水平的鉴定 变性 方法 分子杂交技术 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 探针 15N 15N 转基因生物的mRNA 14N 14N 1 鉴定 分子水平的鉴定 提取 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法 抗原 抗体杂交 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 2 鉴定 个体水平的鉴定 抗虫 抗病接种实验 活性比较实验 例 用棉铃饲喂棉铃虫 如虫吃后不出现中毒症状 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达 如虫吃后中毒死亡 则说明摄入了抗虫基因并得到表达 目的基因的检测与鉴定 检测 导入检测 目的基因是否导入受体细胞 方法 DNA分子杂交 表达检测 转录检测 分子杂交 翻译检测 抗原抗体杂交 分子检测法 鉴定 抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等 个体水平的鉴定 目的基因的表达和检测 课堂练习 1 有关基因工程的叙述中 错误的是 A DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B 限制性内切酶用于目的基因的获得C 目的基因须由运载体导入受体细胞D 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 课堂练习 2 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的 在基因操作的基本步骤中 不进行碱基互补配对的步骤是 A 人工合成目的基因B 目的基因与运载体结合C 将目的基因导入受体细胞D 目的基因的检测和表达 C 拓展深化