生防菌ANTI8098A对青枯雷尔氏菌不同致病力菌株抑制作用的差异性.doc

生防菌 ANTI 8098A 对青枯雷尔氏菌不同致病力菌株抑制作用的差异性 葛慈斌 林抗美 朱育菁 苏明星 刘波 福建省农业科学院生物技术研究所生物农药研究中心 福建 福州 350003 摘要摘要 采用共培养法测定了生防菌 ANTI 8098A 对青枯雷尔氏菌强致病力菌株 F 01 V 和无致病力菌株 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 并以链霉素作参照 结果表明 生防菌 ANTI 8098A 对 F 01 V 的抑制作用较强 抑制率与生防菌培养液菌体 数成正相关 对 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用则较弱 菌体数为 20 0 108 cfu mL 1的生防菌液对 F 1 3 010602 01 A 的抑 制率为 14 7 而对 F 01 V 的抑制率高达 99 5 链霉素对 F 01 V 和 F 1 3 010602 01 A 都具有较强的抑制作用 抑制率 与浓度成正相关 但是对 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用更强 浓度为 0 25 U mL 1的链霉素溶液 对 F 1 3 010602 01 A 的 抑制率为 50 0 而对 F 01 V 的抑制率仅为 3 3 应用生防菌 ANTI 8098 制剂进行田间防治茄子青枯病的试验结果表明 生防菌制剂的防治效果达 92 11 显著地比农用链霉素的防效 72 81 高 研究结果为阐述生防菌 ANTI 8098 对青枯 雷尔氏菌的致弱现象提供了依据 关键词 关键词 生防菌 ANTI 8098A 链霉素 青枯雷尔氏菌 抑制作用 中图分类号 中图分类号 文献标识码 文献标识码 A A Study on the Differences between the Inhibitions of Biocontrol Bacterium Strain ANTI 8098A Bacillus cereus against Ralstonia solanacearum Virulent and Avirulent Strains GE Ci bin LIN Kang mei ZHU Yu jing SU Ming xing LIU Bo Biocide Center Institute of Biotechnology Fujian Academy of Agricultural Science Fuzhou 350003 China Abstract The inhibitions of the biocontrol bacterium strain ANTI 8098A Bacillus cereus against Ralstonia solanacearum virulent strain F 01 V and avirulent strain F 1 3 010602 01 A were investigated and streptomycin was used as control The results showed that the inhibition of strain ANTI 8098A against strain F 01 V was strong There was a positive correlation between the inhibiting rate and the bacteria number of strain ANTI 8098A The inhibition of strain ANTI 8098A against strain F 1 3 010602 01 A was weak The inhibiting rates of the culture of strain ANTI 8098A with the bacteria number 20 0 108 cfu mL 1 against strain F 01 V and strain F 1 3 010602 01 A were 99 5 and 14 7 respectively Streptomycin could inhibit the growth of strains F 01 V and F 1 3 010602 01 A There was a positive correlation between the inhibiting rate and the concentration of streptomycin But the inhibition of streptomycin against strain F 1 3 010602 01 A was greater than the inhibition against strain F 01 V The inhibiting rates of streptomycin with the concentration of 0 25 U mL 1 against strain F 01 V and strain F 1 3 010602 01 A were 3 3 and 50 0 respectively The field experiment on controlling the bacterial wilt disease of eggplant indicated that the strain ANTI 8098 reduced eggplant wilt severity by 92 11 which was significantly higher than that with 72 81 using streptomycin The results provided evidences for explaining the attenuation of strain ANTI 8098A against R solanacearum Key words biocontrol bacterium strain ANTI 8098A Streptomycin Ralstonia solanacearum inhibition 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 是一种分布广泛 影响严重的细菌性病原菌 由该病原菌引 起的青枯病 是茄科作物的重要病害 一般田间发病率为 25 30 严重田块可达 80 100 1 对青枯雷 基金项目 国家 863 计划项目 2002AA244031 2 福建省科技厅重大项目 2000Z031 福建省计委项目 闽计农经 2002 48 号 作者简介 葛慈斌 1973 男 助理研究员 从事植物病虫害生物防治研究 E mail benci2000 通讯作者 刘波 从事生物技术和生物防治研究 E mail fzliubo 尔氏菌的控制 长期以来一直依赖于农用链霉素 但效果不理想 2 对该病原菌的生物防治研究 国内外 有过许多报道 芽孢杆菌 3 4 假单孢杆菌 5 6 链霉菌 7 等有益微生物及生态有机肥 8 9 是常被用于青枯病 生防的重要因子 青枯病生防菌 ANTI 8098A 采自福建番茄青枯病植株根际土壤 经德国菌种保存中心 DMSZ 鉴定为蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 10 试验表明 该生防菌对青枯雷尔氏菌强致病力菌 株具有较强的抑制作用 11 青枯雷尔氏菌不同致病力菌株 对该生防菌的敏感性存在差异 12 本文从青 枯雷尔氏菌强致病力 无致病力菌株对生防菌 ANTI 8098A 的敏感性差异出发 分析该生防菌对青枯雷 尔氏菌不同致病力菌株抑制作用的差异 并以链霉素作对照 探索生防菌对青枯雷尔氏菌无致病力菌株 的定向选择作用及其对青枯病的防治效果 现将结果报道如下 1 1 材料与方法材料与方法 1 1 菌株 培养基及试剂 生防菌 ANTI 8098A 菌株 青枯雷尔氏菌强致病力菌株 F 01 V 和无致病力菌株 F 1 3 010602 01 A 系 分别从福州晋安和闽清番茄病株上分离获得 经 TTC 培养基显色测定 13 和回接番茄组培苗测定 14 确认 其是否具有致病力 青枯雷尔氏菌固体培养基为 TTC 摇瓶培养用蔗糖 蛋白胨 SP 培养基 生防菌固体培养基为牛肉 膏 蛋白胨 NA 培养基 液体培养基为豆饼粉 1 5 玉米淀粉 4 5 酵母粉 1 0 蛋白胨 4 5 硫 酸链霉素为华北制药公司产品 用无菌水配制成浓度为 16 8 4 2 1 0 5 和 0 25 U mL 的溶液 1 2 生防菌培养液和 F 01 V F 1 3 010602 01 A 培养液的制备 接种活化 24 h 的生防菌于液体培养基 培养基装量为 25mL 250mL 三角瓶 接种量为 1 下同 置 30 200 rpm 恒温摇床 HZQ F160 型 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 振荡培养 48 h 后收集 培养液 用血球计数板计算菌体数 取生防菌液原液 配制成菌体数分别为 40 0 20 0 10 0 5 0 2 5 1 25 和 0 6 108 cfu mL 1的系列培养液 备用 接种活化 24 h 的菌株 F 01 V F 1 3 010602 01 A 于 SP 培养基 置 30 200 r min 振荡培养 48 h 后收集培养液 用血球计数板计算菌体数 并将两菌株培养液的菌体数稀释至 1 0 109 cfu mL 1左右 备用 1 3 生防菌对 F 01 V F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 取 F 01 V F 1 3 010602 01 A 培养液各 10 mL 分别加入到 50 mL 三角瓶内 再加入不同菌体数的 生防菌培养液 10 mL 摇匀 置 30 培养箱内静置培养 以分别在 F 01 V 或 F 1 3 010602 01 A 培养液 中加入 10 mL 无菌水作对照 48 h 后取样 用 TTC 培养基平板菌落计数法 下同 15 计算混合液中的 F 01 V F 1 3 010602 01 A 活菌数 计算生防菌对这 2 个菌株的抑制率 对照及处理均设 3 次重复 抑制率 IR 48 h 后 对照活菌数 生防菌液处理后的活菌数 对照活菌数 100 1 4 链霉素对 F 01 V F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 取 F 01 V F 1 3 010602 01 A 培养液各 10 mL 加入到 50 mL 三角瓶内 再加入不同浓度的链霉素 溶液 10 mL 摇匀 置 30 培养箱内静置培养 以分别在 F 01 V 或 F 1 3 010602 01 A 培养液中加入 10 mL 无菌水作对照 48 h 后取样 计算各培养液的活菌数 计算链霉素对 F 01 V F 1 3 010602 01 A 的抑 制率 对照及处理均设 3 次重复 抑制率 IR 48 h 后 对照活菌数 链霉素处理后的活菌数 对照活菌数 100 1 5 生防菌防治茄子青枯病的田间试验 供试茄子品种为 梅茄一号 在茄子苗定植时采用灌根法处理 生防菌 ANTI 8098A 制剂亩施用量 1000 g 稀释浓度为 300 倍 对照药剂 72 农用链霉素亩使用量 112 g 稀释倍数 3500 倍 以清水为空白 对照 每处理 4 个重复 每重复 小区 面积 66 m2 约 120 株 随机排列 于处理后 60 d 进行调查 选择小区的 4 个方向 随机取样 30 株茄子以上 计算发病率和防治效果 发病率和防治效果的计算方法 为 发病率 病株数 调查株数 100 防治效果 对照发病率 处理发病率 对照发病率 100 2 结果与分析 2 1 生防菌 ANTI 8098A 对 F 01 V F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 试验结果见表 1 生防菌对 F 01 V 具有较强的抑制作用 抑制率与生防菌培养液的菌体数成正相关 菌体数为 40 0 108和 20 0 108 cfu mL 1的生防菌液对 F 01 V 的抑制率分别为 99 8 以上和 99 5 显 著地比其它生防菌液的抑制率高 P 0 01 菌体数为 1 25 108和 0 63 108 cfu mL 1的生防菌液对 F 01 V 的抑制率较低 分别为 10 0 和 11 7 生防菌对 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用较弱 菌体数为 40 0 108和 20 0 108 cfu mL 1的生防菌液对 F 1 3 010602 01 A 的抑制率分别仅为 16 2 和 14 7 菌体 数为 1 25 108 cfu mL 1的生防菌液对 F 1 3 010602 01 A 的抑制率为 1 5 菌体数为 0 63 108 cfu mL 1 的生防菌液对 F 1 3 010602 01 A 不具有抑制作用 表 1 生防菌 ANTI 8098A 培养液对 F 01 V 和 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 Table 1 Inhibitions of the biocontrol bacterium strain ANTI 8098A against strain F 01 V and strain F 1 3 010602 01 A F 01 V 的活菌数 108cfu mL 1 F 1 3 010602 01 A 的活菌数 108cfu mL 1 生防菌液的菌体 数 108cfu mL 1 生防菌处理CK抑制率 生防菌处理CK抑制率 40 099 8a5 76 816 2a 20 00 399 5a5 814 7a 10 01 280 0b6 110 3ab 5 04 623 3c6 45 9b 2 54 918 3c6 62 9b 1 255 410 0d6 71 5b 0 635 311 7d7 2 5 9c 注 同一栏内 带相同字母的数字在 Duncan s 新复极差测验的多重比较 P 0 01 时没有显著差异 表 2 3 同 生防菌 ANTI 8098A 在 TTC 平板上不会生长 2 2 链霉素对 F 01 V F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 试验结果见表 2 链霉素对 F 01 V 具有较强的抑制作用 抑制率与链霉素溶液浓度成正相关 浓度 为 16 0 和 8 0 U mL 的链霉素溶液 对菌株 F 01 V 的抑制率均在 99 8 以上 显著地比其它浓度的链霉 素溶液的抑制率高 P 0 01 浓度为 2 0 U mL 的链霉素溶液 抑制率为 53 3 浓度为 0 25 U mL 时 抑制率较低 仅为 3 3 链霉素对 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用强 抑制率也与浓度成正相关 浓度在 2 0 U mL 以上的不同链霉素溶液 对 F 1 3 010602 01 A 抑制率的差异不显著 P 0 01 均在 94 0 以上 浓度为 0 25 U mL 的链霉素溶液 对 F 1 3 010602 01 A 的抑制率仍高达 50 0 表 2 硫酸链霉素溶液对 F 01 V 和 F 1 3 010602 01 A 的抑制作用 Table 2 Inhibitions of streptomycin against strain F 01 V and strain F 1 3 010602 01 A F 01 V 的活菌数 108 cfu mL 1 F 1 3 010602 01 A 的活菌数 108 cfu mL 1 链霉素溶液的浓 度 U mL 1 链霉素处理CK抑制率 链霉素处理CK抑制率 16 099 8a0 036 899 6a 8 099 8a0 0499 4a 4 02 066 7b0 395 6a 2 02 853 3c0 494 1a 1 04 033 3d0 888 2b 0 55 115 0e2 563 2c 0 255 83 3f3 450 0d 2 3 生防菌 ANTI 8098A 对茄子青枯病的防治效果 试验结果见表 3 在处理 60 d 后 清水对照区的发病率高达 42 75 生防菌 ANTI 8098A 制剂处理 组茄子的发病率为 3 37 防治效果达 92 11 显著地比农用链霉素的防治效果 72 81 高 P 0 01 表 3 生防菌 ANTI 8098A 制剂对茄子青枯病的防治效果 处理 处理面积 m2 调查株数 株 病株 株 发病率 防治效果 生防菌 ANTI 8098A 制剂26420873 3792 11a 农用链霉素2642442911 8972 81b 清水对照 CK 2641385942 75 3 讨论 链霉素是对多种作物病原细菌都有较强的抑制作用的有效药剂 黄乃秀比较了青霉素 土霉素等 6 种不同抗生素对培养桉树青枯菌的影响 结果表明农用链霉素对青枯病菌的抑制作用最强 链霉素的抑 菌机理是杀死青枯病菌 随着浓度的提高 抑制作用逐渐加强 浓度达 600 mg kg 时 抑制率达 100 16 本文的研究结果也表明 链霉素对青枯雷尔氏菌的抑制作用强 但对致病力不同的菌株 抑制作用存在 差异 即对无致病力菌株的抑制作用比对强致病力菌株的更强 但是在另一方面 田间应用链霉素防治 青枯病难以获得理想的效果 17 18 原因可能与链霉素浇灌难于彻底杀死病株根际土壤内青枯雷尔氏菌有 关 生防菌 ANTI 8098A 对青枯雷尔氏菌致病力不同的菌株 抑制作用也存在着差异 但与链霉素相反 生防菌对强致病力菌株的抑制作用更强 根据生防菌 ANTI 8098A 对强致病力菌株的抑制作用强 对无 致病力菌株的抑制作用弱这一结果 可以推断 用生防菌 ANTI 8098A 处理青枯雷尔氏菌 更多地抑制 强致病力菌株 保留无致病力菌株 形成对无致病力菌株的定向选择 本研究结果进一步为解析生防菌 ANTI 8098A 对青枯雷尔氏菌抑制作用过程出现的致弱现象 19 提供了依据 在自然条件下 青枯雷尔氏菌不同致病力的菌株会同存于一个生境 帅正彬等 20 研究证明了青枯雷 尔氏菌不同致病力的菌株同时存在番茄田中 组成了一个混合群体 作物青枯病的发生与根际土壤中青 枯雷尔氏菌不同致病力菌株的比例有关 法国 Trigalet 等通过对番茄青枯雷尔氏菌株强致病力菌株 GM1229 进行转座子 Tn5 诱变 获得一批无致病力菌株突变体 21 在温室中对其防病效果进行研究 结 果表明在不伤根接菌的条件下 部分无致病力菌株突变体具良好效果 且其接种量与强致病力菌株接种 量之比越大 防效越好 22 说明青枯雷尔氏菌不同致病力菌株在植株根际的竞争 影响着青枯病的发生 生防菌 ANTI 8098A 对强致病力菌株的抑制作用强 对无致病力菌株的抑制作用弱 实际上是扶持了无 致病力菌株的生长 使得无致病力菌株在作物根际形成优势群体成为可能 从而改变不同致病力青枯雷 尔氏菌在土壤中的比例 达到良好的防治作物青枯病效果 参考文献 1 郭坚华 孙平华 植物细菌性青枯病的生物防治机制和途径 J 中国生物防治 1997 13 1 42 45 2 江忠明 张玉瑞 顾刚 石硫合剂防治烟草青枯病初探 J 烟草科技 2000 2 47 48 3 Anuratha C S and S S Gnanamanickam Biological control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacerum in India with antagonistic bacteria J Plant and soil 1990 124 109 116 4 郭坚华 潘登明 抗青枯生防菌拮抗物质的实质研究 J 南京农业大学学报 1995 18 2 59 62 5 何礼远 康耀卫 利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病性 J 植物保护学报 1990 17 2 113 116 6 靳绍菊 钟士传 用荧光假单孢杆菌防治番茄青枯病 J 农业新技术新方法 1997 1 27 28 7 El Abyad M S M A El Sayed A R El Shanshoury et al Inhibitory effects of UV mutants of Streptomyces corchorusii and Streptomyces spiroverticillatus on bean and banana wilt pathogens J Canidian Journal of Botany 1993 71 8 1080 1086 8 Hsu S T and M L Chang Effect of soil amendments on survival of Pseudomonas solanacerum J Plant Protection Bulletin Taiwan 1989 31 21 33 9 蔡燕飞 廖宗文 章家恩 等 生态有机肥对番茄青枯病及土壤微生物多样性的影响 J 应用生态学报 2003 14 3 349 353 10 刘波 朱育菁 曹宜 等 青枯病生防菌 ANTI 8098A 的鉴定 J 中国生物防治 2003 19 S 5 8 11 刘波 林营志 朱育菁 等 青枯病生防菌 ANTI 8098A 的对青枯雷尔氏菌的抑菌作用 J 中国生物防治 2003 18 S 2