本科论文模板.doc

青岛农业大学本科生毕业论文（设计）题 目： 姓 名： 学 院： 生命科学学院 专 业： 生物科学 班 级： 200级班 学 号： 指导教师： 完成时间： 20年月日目 录中文摘要1ABSTRCT 11.引言11.1中度嗜盐菌的概述31.2脂肪酶的研究及应用31.3本实验研究的目的和意义42.材料和方法52.1材料52.1.1菌种的来源52.1.2试剂仪器52.1.3 培养基52.2方法 62.2.1菌种的活化和培养62.2.2筛选能降解tween-60的菌株62.2.3菌种的形态学鉴定62.2.4菌种的生理生化鉴定72.2.5 A5生长曲线的测定92.2.6 质粒的提取93. 实验结果93.1分离筛选及形态学鉴定结果 103.3.2生长曲线的测定结果 103.3质粒的提取结果 124.讨论 13致谢 14参考文献 15降解Tween-60的中度嗜盐菌的筛选与鉴定生物科学专业 指导老师 摘要：本实验试图从实验室中液体石蜡封存的125中菌种中筛选出能降解Tween-60的中度嗜盐菌。经含1% Tween-60 DSMZ-755培养基的筛选，获得51株能降解Tween-60的中度嗜盐菌有。根据水解圈直径与菌落直径之比筛选出10株产酶活性相对较高的菌株,分别为A5、 I1、I11、I9、J14、F3、E4、J5、F5和J2。经革兰氏染色观察其中90%以上的为革兰氏阳性杆状菌。并初步的对所筛选的菌种耐盐性，碳源的利用情况，产脂肪酶，淀粉酶的情况及其他的生化特征做了一些了解。选出其中一株产酶活性较高的菌株A5并在液体培养后测定其生长曲线。最后提取质粒发现筛选的菌株中不存在质粒。关键词:中度嗜盐菌；脂肪酶；筛选；鉴定；质粒Screening and characterization of the moderately halophilic bacteria degrading tween-60Student majoring in Biological Sciences Tutor ABSTRACT: This Experiment tries to Screen the Moderately Halophilic bacteria strains that can degrade Tween-60 from one hundred and twenty-five bacteria that were mothballed in the liquid paraffin. we get fifty-one target strains through Screening in culture medium of DSMZ -755 that Contains one percent Tween-60. Then ten strains were selected for their relative high enzymes activity depending on HC values，they are A5，I1，I11，I9 ，J14，F3，E4，J5，F5，J2. Ninety percent of them are Gram positive. we have a preliminary research on them from salt tolerance, the utilization of C source, the ability of producing amylase and protease and some other conditions affecting them. Specially we get a strain designated as A5 who have high enzymes activity and have a determination of growth curve. Finally we extract the plasmid with alkli lysic method and no plasmid was detected.Key words: Moderately halophilic bacteria；Lipase；Screening；Identification；Plasmid1引言1.1中度嗜盐菌的概述最早是LeFevre和Round对中度嗜盐菌的研究，1919年他们从黄瓜发酵盐水中分离到一个类群的无色素的细菌。Hof .T.在1935年分离到一株能在3%-18%盐浓度生长的细菌，并将其命名为Pseudomonnas beijerinckii。但是直到1956年中度嗜盐菌的名字才被使用（任培根等，2003）近几年来对嗜盐古菌的研究较为详细，对中度嗜盐菌的研究相对较少。中度嗜盐菌并不是分类学上的名词，Kushner（Kushner D J，1978）曾这样定义中度嗜盐菌（Moderately halophilic bacteria）：在0.5 mol/l（3%）和2.5 mol/l(15%) NaCl 浓度之间有最佳生长的细菌。但是由于其受温度和环境的影响较大而且其种属的变动很大，是由不同属的细菌组成的异源生理类群,即凡是能耐高盐浓度的细菌均归属到这个类群,所以其所承受的盐浓度的范围并不是绝对的界限。如（Ghozlan H et al,2006）Halomonadaceae 科、Halobacillus属、Marinococcus属、Paracoccus属、Pseudomonas 属、Flavobacterium 属和 Filobacillus 属等,其中一些属中同时含有非嗜盐种,并且一些种曾被重新命名过,所以其分类尤显混乱(吕爱军等，2003) 。已有文献报道(Staley J T,1984)中度嗜盐菌Halomonadaceae 科包括3个属,即Halomonas, Chromohalobacter和Zymobacter。随着人们研究水平的不断的进步一些新发现的细菌也逐渐的被列入相应的属中。Dobson等根据16SrDNA序列分析将单胞菌属、德莱氏菌属和盐弧菌属归入盐单胞菌属(Dobson S J,1993)。由于中度嗜盐菌的生长环境很特殊，与普通微生物相比，其遗传的特性及代谢方式也比较的独特，各个国家都相应启动了研究计划，在利用其特殊机制和特殊产物方面都做里努力和竞争。已逐渐成为国际研究的趋势，主要的研究工作包括：（1）新物种的发现（2）新产物的研究和生产（3）所产酶的结构及功能及其基因的克隆表达（4）适应机理的分子基础及遗传原理（5）基因组分析。不过人们现在首先主要是对其耐盐的机制研究的研究。普遍认同的是中度嗜盐菌耐盐机制为：相容性溶质(Compatible solutes)的积累。即通过在细胞内积累一些被称为相容性溶质(Compatible solutes) 的物质（高度水溶性的小分子物质,如糖,糖醇,其它的醇类,氨基酸,及氨基酸的衍生物）来抵抗细胞外的高渗透压。维持细胞的形态、结构和生理功能。但这种物质不妨碍细胞的其它代谢途径。不同的生物各自积累不同的相容性溶质:如KCl在古菌中，多元醇(Polyols)在真核生物中,而甜菜碱和四氢嘧啶在细菌中(Imhoff J F,1984)。甜菜碱和四氢嘧啶属于氨基酸衍生物,中度嗜盐菌既可以从环境中直接获取它们,也可以从环境中吸收它们的底物(如胆碱等)来合成它们.由于中度嗜盐菌的特殊的代谢机理，能够产生具有特殊功能的酶及其他的活性物质。在医药，食品，化工，环保等领域有重大的应用潜力。很多的实验室致力于产酶的中度嗜盐菌的筛选及条件优化的方面，在社会生产中推广应用。1.2 脂肪酶的研究及应用 脂肪酶(三酰甘油酰基水解酶EC3.1.1.3)是工业酶制剂中最重要的酶类之一。即甘油三酯水解酶是一类特殊酯键水解酶，它的底物甘油三酯的醇部分是甘油，而酸部分则是水不溶的12个碳原子以上的长链脂肪酸。因此它只能在异相系统，即在油(或酯)-水的界面上起作用，对均匀分散的或水溶底物不起作用，即使起作用也极缓慢。但它作为一种生物催化剂,已广泛应用于疾病治疗、油脂水解、食品发酵、轻工产品脱脂、洗涤剂工业以及化工产品生产等方面(彭立凤等，2000)。人们最初的研究是对动物植物中脂肪酶的研究，除动物胰脏脂肪酶活性较为稳定外，其他的均含量少而且活性较低。植物中主要存在于植物种子中，不过由于其种类的特异性和反应条件的限制，目前研究的也相对较少。由于微生物脂肪酶种类多，比动物植物有更广的批H反应温度及高度的底物特异性，人们转移到对微生物脂肪酶的研究，主要是在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用等方面，且取得了很大的进展。我国碱性脂肪酶的研究始于1970年代福建师大生物工程学院施巧琴教授于1981年发表了我国第一篇关于碱性脂肪酶产生菌突变株UN一503的选育的研究论文，吴松刚1991（吴松刚，2001）年和1992年分别分离出Pseu.pseudoalcaligones和Baci coagulaus产生的碱性脂肪酶;周延（周延等，2001）利用紫外线、快中子、磁场复合诱变，得到了发酵液酶活力为24.60u/m1的变株，此酶活力为初发菌的3.0倍。脂肪酶分子生物学的研究进展较快（邹显章，2002），到目前为止已克隆了包括微生物和动植物在内的众多脂肪酶基因，测定了它们的核苷酸序列，从而确定了这些酶的氨基酸一级结构。就细菌脂肪酶而言，假单胞杆菌属的研究较为深入，现在已经测定了许多细菌的脂肪酶的基因序列所对应的氨基酸序列已经被测定，一部分基因在相应的宿主中得到表达例如Staphylococcus hyicussubsp hyicus 的脂肪酶基因已在Staphylococcus carnosus 和 Escherichia coil中进行了表达研究。随着对脂肪酶研究的深入，脂肪酶也逐渐的应用到生活的各个领域中。食品工业中脂肪酶可用于乳制品和黄油的增香剂脂肪酶可用于乳制品和黄油的增香。也可改善稻米和酒精饮料香味,如在酒精饮料发酵过程中加入一定量脂肪酶,产品具有类似奶酪香味。脂肪酶还能用于无脂肪肉的生产,如在鱼加工过程中用脂肪酶除去脂肪。医药工业中可通过脂肪酶外部调节可达到助消化目的,也可用于恶性肿瘤的治疗和肠胃功能紊乱消化不良的治疗，溶解人体内的胆结石。在洗涤工业中加入脂肪酶大大的提高了其去污的效果。另外脂肪酶在造纸和皮革生产等方面也有非常重要的作用。同时脂肪酶及其催化合成生物柴油的应用，又进一步拓宽了微生物脂肪酶的应用领域。1.3 本实验的目的和意义由于高盐环境的特殊性,极端环境微生物及其所产生的酶也相应具有一些特殊的性质。因此若从极端环境中定向分离各种特殊性质脂肪酶的产生菌,并在研究其性质的基础上妥善保存,构建一个脂肪酶产生菌的菌种库,无论对于生产还是科研都具有极大的实用性。基于此目的,所以设计了一种较为简便的定向筛选方法,对产脂肪酶的中度嗜盐菌进行了分离,初步定性的研究了一下所筛选菌的生理生化性质。我们对产脂肪酶的中度嗜盐菌的筛选及其性质的研究只是一个开始，对其所产脂肪酶的分离及纯化还需根据现在初步了解的性质进一步的研究，然后把脂肪酶的应用得到最大程度的发挥。2.材料和方法2.1 材料2.1.1 菌种来源青岛农业大学微生物实验室中液体石蜡封存在试管中的125种菌种2.1.2 试剂与仪器(1)试剂：NaCl（天津市广成化学试剂有限公司），蛋白胨（天津市大茂化学试剂厂）,MgSO47H2O（莱阳市康德化工有限公司），酵母粉（OXOID），Tween-60（天津市巴斯夫化工有限公司, 分析纯），氯化钾（天津市巴斯夫化工有限公司），葡萄糖（天津市北方天医化学试剂厂），麦芽糖（中国惠兴生化试剂有限公司），蔗糖（天津市科密欧化学试剂开发中心），可溶性淀粉（天津市河东区红岩试剂厂），果糖（天津市巴斯夫化工有限公司），山梨醇（天津市化学试剂分公司），半乳糖（上海试剂二厂）等。(2)仪器： 电子天平（Ohaus Corp pine Brook MJ.USA ），超净工作台（哈尔滨东联电子技术有限公司北京分公司），高压灭菌锅（SANTO Electric Co.Ltd），DRP-9082型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司），冷冻高速离心机（飞鸽牌），紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），HZQ-F160型振荡培养箱（中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），超纯水系统（pall corporation）磁力加热搅拌器79-1（国华）电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），DYY-12型电脑散恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂），移液枪（北京青云卓立精密设备有限公司）2.1.3培养基 DSMZ-755固体培养基：NaCl 10%，胰蛋白胨 0.5%，MgSO47H2O 0.5%，酵母粉 0.3g%，琼脂 1.8%， PH=7.5DSMZ-755液体培养基：NaCl 10%，胰蛋白胨 0.5%，MgSO47H2O 0.5%，酵母粉 0.3g%，PH=7.5DSMZ-755筛选培养基：NaCl 10%，胰蛋白胨 0.5%，MgSO47H2O 0.5%，酵母粉 0.3g%，Tween-60 1%， 琼脂 1.8%， PH=7.52.2 实验方法2.2.1菌种的活化和培养在超净工作台中，把液体石蜡封存的125种菌种转移到DSMZ -755培养基，37在培养箱内培养10-16个小时，再用灭菌的牙签把菌种点到新的DSMZ -755培养基上继续培养活化.活化后的菌种分别在新的DSMZ -755培养基上划线分离出单个的菌落2.2.2筛选能降解tween-60的菌株初筛：在超净工作台上，挑取上述分离纯化的菌种，接种到含有1.0% Tween-60的DSMZ-755固体培养基上培养大约34天。然后观察所长菌落周围有无白色或透明的晕圈产生，如果有就说明此菌种可能产脂肪酶降解Tween-60.晕圈直径与菌落直径比值（HC值）愈大，表示该菌株产脂肪酶能力愈强。从中选择晕圈直径与菌落直径比值较大的菌株再进行复筛。复筛：将初筛到的产脂肪酶能力较强的菌株，分别转接于含有1.0% Tween-60、不同NaCl浓度和pH值的DSMZ-755固体培养基上,于37oC条件下恒温培养3-5d。根据HC值选取降解tween-60能力稳定的菌株。2.2.3菌种的形态学鉴定（1）菌落的形态学观察将筛选出的菌株接种于DSMZ-755固体培养基上，置于37恒温箱中培养23d后,观察菌落的形态特征。（2）革兰氏染色及菌体的形态学观察 将筛选出的菌株接种于DSMZ-755固体培养基上，置于37恒温箱中培养23d后，革兰氏染色并观察细胞形态，拍摄照片，并将菌株名称、菌体形态及革兰氏阴、阳性分别记录下来。经典的革兰氏染色具体步骤如下：第一步：涂片 。 在洁净无油污的载片中央滴上一滴水，用无菌的接种环挑少量的菌与水滴充分混匀，并涂成极薄的菌膜。第二步：固定。涂片在空气中干燥。手执载玻片一端，有菌膜的一面向上，通过微火三次（用手指触涂片反面以不烫手为宜）。待冷却后再染色。第三步：初染滴加草酸铵结晶紫染液染色1min,倾去染液水洗至洗出液为无色；第四步：媒染碘液冲去清水再滴加碘液染色12min；第五步：脱色手执载玻片使之倾斜然后在滴加95%乙醇脱色2030秒，然后立即用自来水冲洗终止脱色。第六步甩去水珠最后再滴加番红进行复染2-3min，水洗然后置于环境中自然风干后，油镜下镜检。（3）氢氧化钾实验将筛选出的菌株接种于DSMZ-755固体培养基上，置于37恒温箱中培养23d后，进行氢氧化钾实验来检验革兰氏染色结果的可靠性。具体方法如下：将3%(w/v)的KOH溶液滴在洁净无油污的载玻片中央，用无菌的接种环挑少量的菌与KOH溶液充分混匀约2min，然后将接种环轻轻挑起，观察是否有菌丝生成。若有菌丝生成则为革兰氏阴性菌；若无菌丝生成则为革兰氏阳性菌。2.2.4菌株进行生理生化鉴定（1）NaCl耐受性实验分别配置NaCl浓度分别为0%、5%、10%、15%、20%的固体DSMZ-755培养基，过夜烘干然后用灭菌的牙签点种在固体平板上，37培养23d，观察菌落的生长情况并记录。（2）pH条件的影响将DSMZ-755培养基的pH值调到分别为5、6、7、8、9、10、11、12，制成固体平板。用灭菌的牙签点种平板后，37恒温箱中培养23d，观察菌落的生长情况并记录。（3）碳源的利用情况在DSMZ-755基础培养基中分别加入1%(w/v)的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、半乳糖，制成固体平板。用牙签点种平板后，37恒温箱中培养35d，观察菌落的生长情况并记录。（4）降解Tween-40实验用灭菌的牙签将菌种点到含有1%的Tween-40DSMZ-755培养基中，制成固体平板，37恒温箱中培养35d，观察菌落周围是否有白色或透明的晕圈产生。有晕圈产生则为阳性；无晕圈产生则为阴性。（5）产淀粉酶实验将DSMZ-755培养基中加入1%（w/v）的可溶性淀粉，制成固体平板，用牙签点种平板后，37恒温箱中培养35d，在平板上滴加碘液，观察菌落周围是否有透明水解圈产生。有透明水解圈判断为阳性；无透明水解圈判断为阴性。（6）产蛋白酶实验将DSMZ-755培养基中加入1%（w/v）的脱脂奶粉，制成固体平板，用牙签点种平板后，37恒温箱中培养23d，观察菌落周围是否有透明水解圈产生。有透明水解圈则为阳性；无透明水解圈判断为阴性。（8）产过氧化氢酶实验将筛选出的菌株接种于DSMZ-755固体培养基上，置于37恒温箱中培养23d后，将3%的H2O2溶液滴加到菌落上，室温放置2min后，观察菌落周围是否有气泡产生。若有气泡产生，则该菌产过氧化氢酶；若无气泡产生，则该菌不产过氧化氢酶。2.2.5 A5生长曲线的测定分别配制含NaCl浓度（w/v）、5%、10%、15%、20%的DSMZ-755液体培养基各50ml，同样121123灭菌1520min，冷却后，用移液枪取A5母液中菌种1ml，分别接入无菌的5%、10%、15%、20%的DSMZ-755液体培养基中，37、150rpm的摇床振荡培养。每隔1h取发酵液1ml放入比色皿中，用紫外可见分光光度计测出在600nm下的吸光度（OD600值）。将不同时间培养液的OD值并记录下来，绘制不同盐度下菌株的生长曲线。对照为没接菌种的相应浓度的液体培养基。2.2.6质粒的提取（微量碱裂解法提取质粒）许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，现已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%3%。决定细菌某些遗传特性的基因可能在染色体DNA上，也可能在质粒DNA上。因此降解Tween-60的基因除在染色体外也能存在质粒中。步骤：（1）无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。（2）沉淀中加100l用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧烈振荡）。使菌体悬浮。室温下放置10min（3）加入200l溶液II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5min。(4）加入150l预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min。(5）微量离心机上4，12000rpm离心15min，取上清液于另一新的Eppendorf管中。 (6)上清液中加入2倍体积(约350ul)的无水乙醇混匀，室温下放置30min (7)放入离心机中12000rpm,离心15min。弃上清（将离心管倒置于吸水纸上）(8)加入1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀12次,沉淀在室温下晾干。（9）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。自然干燥10min-15min（10）加入50lTE缓冲液溶解质粒粗提物，在-20保存。(11)电泳观察3实验结果与分析3.1分离筛选及形态学鉴定结果经过在DSMZ755培养基初筛和复筛，我们从实验室中的125中菌种中筛选出降解 Tween-60能力较强的十种菌株。表格 1所选菌种的形态观察菌名 菌落形态 HC值 菌体形状 革兰氏染色 A5 浅黄色，圆形，中凸 ，边缘不规则 0.6 短杆状 G+I11 浅红色，表面光滑 3.0 杆状 G+I9 浅红色，圆形，中凸 1.5 短杆状 G+F3 乳白色，中间浅灰色， 椭圆，中凹 2.2 杆状 G+E4 黄色，圆形，表面规则 1.9 短杆状 G+I1 浅红， 中凹，边缘规则 2.5 杆状 G-J2 浅红，中凹，边缘不规则 1.7 短杆状 G+F5 乳白色，湿润 1.3 杆状 GJ14 浅红色，圆形，中间凹陷 0.8 短杆状 G+J5 乳白色，圆形 ，中凹 1.0 杆状 G+由表1可知，大多数菌为革兰氏阳性杆状菌，革兰氏染色结果与KOH实验结果不完全相符，但其中I1 和J5 和革兰氏染色矛盾，即这两种菌为革兰氏阴性. 图2所筛选菌株的水解圈 图3 A5菌株的革兰氏染色油镜照片表4 部分产脂肪酶菌株的生理生化鉴定菌株号 I9 J14 I11 F3 A5 E4 I1 J5 F5 J20% NaCl 5% NaCl + + + + + + + + + +10% NaCl + + + + + + + + + + +15% NaCl + + + + + + + + + +20% NaCl + + + + + + + + + +pH 5 + + pH 6 + + + + + + + + + +pH 7 + + + + + + + + + + +pH 8 + + + + + + + + + + +pH 9 + + + + + + + + + +pH 10 + - + + + + + - +pH 11 + - - + + - + + + pH 12 - - - + - - - + - +Tween-40 - + - - - + + - -淀粉酶 + + + + + + + + + +蛋白酶 + + + - + + + +过氧化氢酶 + + + + + + + - + +葡萄糖 + + + + + + + + + +麦芽糖 + + + - + + + + +蔗糖 + + + + + + + + + +果糖 + + + + + - + + + +半乳糖 - + + + + + - - -注：表中“+“表示生长，“+“表示生长良好，“表示不生长 33.2生长曲线的测定上图可以看出不同的盐浓度中度嗜盐菌的生长情况不同。其中10%，15%的NaCL浓度生长相对较快，而20% NaCL,5%NaCL下基本不生长。前几个小时生长都较为缓慢，9小时后才慢慢生长，在10%的盐浓度下在13小时后几乎达到稳定期3.3质粒的提取结果图6 6个菌株质粒提取电泳结果 由图可以看出所提的几种细菌中不存在质粒，由此可以初步断定决定降解tween-60的基因存在于细菌的染色体DNA上。4讨论本实验中的菌种的筛选是跟据所产生的胞外脂肪酶的化学特征，即以在固体培养基中是否有透明圈为依据。但所有菌种在液体培养基所测的酶活大小和在固体培养基中的透明圈的大小不太一致，排除实验误差外，我们知道所有酶都有一个最适的温度，但透明圈的产生是在37的恒温培养箱中产生的，经资料显示脂肪酶的最适温度高于37，所以在这个温度下并不是脂肪酶活较高的时候。即透明圈的大小只是反映了相对的酶活性。另外，在所产生的透明圈中，其中透明圈的性质也不相同，有的为透明的，有的为白色的透明圈，这可能和所产脂肪酶和底物tween-60的作用机理不同所导致的。所以本实验中降解tween-60的中度嗜盐菌的筛选的过程有待于进一步的改进。第一个质粒pMH1是从中度嗜盐菌H. elongata提取的(Fernandez-Castillo. R. C et al ,1992)，后来发现这个质粒也存在于H. halmophila, H. halophila, and S. costicola。之后并绘制了其酶切图谱， 构建了在大肠杆菌和中度嗜盐菌之间穿梭的两个穿梭载体系列。为中度嗜盐菌的基因的克隆提供了基础。研究较多的是与其嗜盐机制有关的基因。但是对于中度嗜盐菌的产脂肪酶的基因的研究相对较少。致谢参考文献1吕爱军,刘缠民,华栋,等.盐田中嗜盐菌的初步研究J.海洋科学,2003,27(12):5-62彭立凤,赵汝淇,谭天伟.微生物脂肪酶的应用J.食品与发酵工业,2000,26(3):68-733任培根,周培瑾.中度嗜盐菌的研究进展