PAKAUTO操作说明.doc

GTI血小板自身抗体检测试剂盒（GTI-PAKAUTO ）注：按照每人份使用1条进行实验，阴性对照为1条，详细步骤请见原始英文使用说明书。用去离子水稀释10x洗液，1倍体积Conc. Wash + 9倍体积去离子水。在记录纸（RS）上标记检测格局。1.用稀释液SD按照3：1比例稀释阴阳性对照、病人血清。稀释液SD量血清量PC150l50lNC300l100lPatient serum 300l100l2.从病人血小板及正常血小板中分离得到血小板扣A）取由EDTA 抗凝的血样，离心（110-150rcf，10-15min ）,得到富含血小板的血浆（PRP）。B）将PRP移入一个洁净的多聚丙烯管中，离心（12000rcf, 5-10min），得血小板扣。弃掉血浆。C）向血小板扣中加入500ul 细胞重悬防腐液（ CRP），用小枪头轻轻吹打混匀。将此血小板悬浊液移入离心管中，用至少500ul CRP洗3次。D）制备含1-5 x 107血小板的血小板扣：用CRP重悬上步的血小板扣，将血小板的浓度调节为每微升悬液含10000-50000个血小板。 取1ml 此悬液入离心管，离心12000rcf, 5min。（或者直接取10-15ul 体积的血小板扣也可，此量足以制备血小板洗脱液）3制备血小板对照A）向阳性血小板对照（PCP）、阴性血小板对照（NCP）中加入500ul CRP，室温放置至少10分钟使之水化。轻轻混匀后离心12000rcf, 5-10min。吸干液体残留以得到干燥的血小板扣。注意：最好用新鲜的正常血小板制备正常血小板洗脱液，如果没有新鲜的血小板再用试剂盒中提供的干正常血小板。4制备洗脱液A）在制备洗脱液前要确保血小板已完全沉淀，且不混有残留的CRP。B）向已制备的血小板扣中加入180ul 洗脱液（ES），枪头吹打混匀，室温放置2分钟。离心12000rcf, 5min。C）迅速将洗脱液转移到一个干净的离心管中，加180ul BS , 充分混匀，离心12000rcf, 10min。5立即进入下一步实验，或将血小板洗脱液放-80度冻存。注意：切勿稀释血小板洗脱液。6向每个微孔内加300ul 用去离子水稀释好的洗液，室温放置5-10分钟。7甩干，倒扣于吸水纸上。8向相应孔内分别加入50ul 血小板洗脱液、已稀释好的对照血清、患者血清。注意：空白孔中不加任何血清或洗脱液；如果一次检测多个样本，只需做一组对照（阴、阳性血清对照，阴、阳性洗脱液对照）；将每一条都做好标记，以免出错。9盖膜，37度孵育30-35分钟，孵育时板底要接触到水，如果接触不到水，应延长孵育时间5-8分钟。10.用稀释液SD 1：100稀释抗-IgG。稀释液SD量抗-IgG量每次2条2000l20l每次6条6000l60l11 取出板子，洗板4次， 甩干。 12用稀释液SD1：100稀释抗-IgG。稀释液SD量抗-IgG量每次2条2000l20l每次6条6000l60l13除空白孔，每孔加已稀释的抗-IgG 50l，盖膜，37度30分钟.(水浴孵育时,板底要接触水面;若为空气浴则应将孵育时间延长5-8分钟)14. 用0.5ml去离子水溶解1瓶PNPP粉末，然后用底物缓冲液1:100稀释。 避光。SBPNPP每次2条4ml40l每次6条12ml120l15取出板子，洗板4次， 甩干。16除空白孔，每孔加已稀释的PNPP 100l，室温避光30分钟。实验环境温度必须保持在22-25度. (如果夏天室内温度较高,最后一步显色时间应适当缩短, 约25分钟即可.)17加终止液。所有孔加100l，空白孔加200l终止液。18405-410nm读值，490nm或630nm为参照波长。结果判断：（阴性对照孔的均值） X （2）= Cutoff值，OD值大于Cutoff值即被判读为阳性附录2：PAK注意事项：1稀释液SD最好用前分出所需的总量，避免加样器反复取用污染。2实验环境温度必须保持在22-25度。3稀释抗-IgG不能用玻璃或有机玻璃管，应该用塑料管，即聚乙烯管，如1.5ml离心管。4切记底物必须用去离子水溶解，用底物缓冲液稀释，不要混淆。底物溶解后，需避光保存，用前稀释。而且一经溶解，只能使用一次。5上酶标仪读数时将板底用纸巾擦干净。6阳