T载使用中常见问题.docx

T栽使用说明Q-1：TA克隆的原理?大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都会在PCR产物的3末端添加一个“A”，T载体是3带有一个“T”的载体，在连接酶作用下，完成连接，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。TA克隆的原理请见下图：Q-2：蓝白斑筛选的原理?蓝白斑筛选原理是：载体上携带一段细菌的lacZ基因，它编码-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的-肽，载体转化的受体菌为lacZM15基因型。这样，载体同宿主通过互补，具有完整的-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA，造成lacZ基因缺失，不能合成-肽，失去同宿主的互补，不能形成有功能的-半乳糖苷酶，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为白色菌落（质粒载体）或无色噬菌斑（M13噬菌体载体）；非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。Q-3：Takara有哪些常用的PCR产物克隆用T载体，各有什么特点?常用的PCR产物克隆用T载体及各自的特点请见下表：Code No.产品特点应用3275pBackZero-T Vector Cloning Kit由pUC19改建，阳性克隆率极高而背景极低。它消除了pUC19载体上的lacZ基因及多克隆位点，并对-lactamase (bla) 基因进行了独特的改造，可以定向克隆。使用时需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5端加上TTTAA 5个碱基。如果需要进行定向克隆，只需在一条引物的5端加上TTTAA 5个碱基。 PCR产物3端有“A”，TA克隆。6011pMD18-T Vector Cloning Kit由pUC18构建，含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3端有“A”，TA克隆。6013pMD19-T Vector Cloning Kit由pUC19构建，含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3端有“A”，TA克隆。3271T-Vector pMD19 (Simple)由pUC19构建，不含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3端有“A”，TA克隆。根据实验需要，可以在引物的5端导入酶切位点。6012pSIMPLE-19EcoR V /BAP Vector由pUC19构建，不含有多克隆位点，是种平末端去磷酸化载体，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。与5端磷酸化的平末端PCR产物进行连接。3270T-Vector pMD20由pUC19构建，含有多克隆位点；并对lacZ基因进行改造，降低假阳性，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。PCR产物3端有“A”，TA克隆；含有SP6 Promoter，可以对插入的DNA进行体外转录。Q-4：pMD19-T Vector与pMD18-T Vector相比，有何不同?pMD19-T Vector与pMD18-T Vector相比，-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMD18-T Vector连接转化后，一般要经37过夜培养，然后再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能显色。而pMD19-T Vector涂板培养后一般只需10个小时（37）便可以显色。因此，pMD19-T Vector比pMD18-T Vector更适合于蓝白菌落的筛选。Q-5：使用Takara的T载体，对感受态细胞有什么要求?转化时请使用高效的感受态细胞（转化效率1108cfu/g pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F编码的lacZM15）产生 Fragment，才可能和载体DNA产生的lacZ 多肽相结合，表现出-半乳糖苷酶活性（-互补性），才可以进行蓝白筛选。通常使用的JM109，DH5等细胞均可进行蓝白筛选。Q-6：使用Takara的T载体，对Insert DNA有什么要求?使用Takara克隆用T载体，对Insert DNA有以下的要求：1Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。2Insert DNA的使用量及计算方法。进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1：310，可以根据具体的实验情况选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用量的计算方法如下：Insert DNA的使用量（ng）=nmol数660Insert DNA的bp数Takara的T载体1 l（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。Q-7：如何计算感受态细胞的转化效率?取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 l的感受态细胞中进行转化，再加入900 l的SOC培养基（0.1 ng DNA/ml），将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng DNA/ml）取100 l涂布平板（0.001 ng DNA/100 l），记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2105cfu/ng=2108cfu/g pUC19 DNA。Q-8：使用Takara的T载体，转化后的菌落全为蓝色（或淡蓝色），但有目的DNA片段的插入，为什么?插入的DNA片段较短（小于500 bp），且插入片段没有影响lacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。Q-9：使用Takara的T载体，怎样提高连接转化效率?应该从以下几点进行改善1确认Insert DNA片段的3末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等）扩增的PCR产物是平滑末端，不能直接进行TA克隆。2纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用Takara凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。3请使用转化效率大于108cfu/g pUC19 DNA的感受态细胞。4DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。5进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。6Solution I应尽量避免反复冻融。7建议使用新配制的平板培养基。Q-10：使用Takara的T载体，欲对克隆DNA片段进行测序时，使用何种引物?通常使用载体的通用引物进行测序。1pMD18-T Vector来源于pUC18载体，M13-47和RV-M等pUC18载体测序的通用引物都可以使用。2pMD19-T Vector、T-Vector pMD19 (Simple)和pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector来源于pUC19载体，M13-47和RV-M等pUC19载体测序的通用引物都可以使用。3T-Vector pMD20来源于pUC19载体，M13-47和RV-M等pUC19载体测序的通用引物都可以使用。Q-11：使用Takara的T载体，需要注意哪些问题?1 Solution I请于冰中融解。2克隆时使用的Insert DNA片段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。3按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 l。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用Dr.GenTLEPrecipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高DNA的回收率。4连接反应请在25以下进行，温度升高（26）较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。5Takara克隆用T载体来源于pUC18或pUC19载体。因此，适合pUC18和pUC19载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109等。Q-12：使用Takara的T载体，阳性克隆鉴定方法有哪些?阳性克隆的鉴定方法有多种，主要的方法有以下几种：1蓝白斑筛选。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，一般情况下，-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与lacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kb的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。2菌落PCR方法。以变性后的菌液为模板，使用载体通用引物进行PCR扩增鉴定。使用灭菌后的牙签挑取白色菌落，在预备好的dH2O（10 l）中蘸洗，99，10 min变性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer，TaKaRaTaq等）。941 min9430 sec5530 sec30 Cycles721 kb/min说明：a所用引物通常为载体通用引物。Takara克隆用T载体的通用引物为BcaBEST Primer RV-M和BcaBEST Primer M13-47，序列详见载体说明书。b扩增产物的大小为载体通用引物之间大小+插入片段大小。Takara的T-Vector pMD20通用引物之间大小约为200 bp，其它的载体为150 bp左右。3质粒PCR方法。以提纯后的质粒DNA为模板，使用PCR扩增引物进行PCR扩增鉴定。941 min9430 sec5530 sec30 Cycles721 kb/min说明：扩增产物的大小就是PCR产物的大小。4酶切方法。利用载体多克隆位点上限制酶或者PCR引物导入酶切位点的限制酶，对提纯后的质粒DNA进行双酶切鉴定。说明：双酶切后，电泳显示两条带，分别为载体大小和PCR产物的大小。Q-13：使用Takara的T载体，进行菌落PCR阳性鉴定时，使用PCR扩增用引物检测为阳性，但测序却为假阳性结果，为什么?作为模板的菌落中，若混杂有微量的PCR产物，使用PCR扩增用引物就能检测到目的条带，而并非菌落自身扩增的PCR产物。为了避免出现假阳性现象，建议使用载体上的通用引物作为鉴定阳性克隆的扩增引物。Q-14：使用Takara的T载体，如何鉴定插入片段的方向?TA克隆没有方向性，但是可以通过以下方法进行方向的鉴定。1PCR方法。使用载体上的一条通用引物和PCR扩增的一条引物，分别作为PCR扩增的上下游引物，对阳性克隆进行PCR扩增，通过是否有扩增产物来判断片段插入的方向。2酶切方法。利用载体多克隆位点上的一个限制酶和PCR引物导入的酶切位点的一个限制酶，对阳性克隆质粒DNA进行双酶切鉴定。Q-15：使用Takara的T载体，阳性对照实验（Control Insert）有什么意义?为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的Control Insert，可以进行10次阳性对照实验。Q-16：使用DNA A-Tailing Kit，怎样提高克隆效率?可以从以下几点进行改进：1. 为了提高加“A”反应效率，用于加“A”反应的末端平滑DNA片段应进行切胶回收的纯化处理，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。2. 请使用转化效率大于108cfu/g pUC19 DNA的感受态细胞。3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影