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血细胞分析仪测定原理与参数解析 1 简介血细胞分析仪检测原理血细胞分析仪检测参数原理检测参数 报警 临床应用 2 简介 3 自动血细胞分析仪 早年称血细胞技术仪 已是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一 20世纪50年代初 美国W H Coulter申请了粒子计数法的技术专利 在世界上研发了第1台电子血细胞技术仪 并应用于临床 开创了血细胞计数的新纪元 从此 随着基础医学和高科技 特别是计算机软件技术的发展 其检测原理逐渐完善 检测技术不断创新 检测的参数显著增多 4 传统手工法显微镜血细胞计数或分类方法 不仅速度慢 而且因操作过程的随机误差 实验器材的系统误差和检测方法的固有误差 检测的精密度不高 精度高 速度快 易操作 功能强 是血细胞分析仪的强劲优势 还可和血涂片制备和染色仪进行组合 由后者完成血细胞分析仪检测后的形态学复检 5 现代血细胞分析仪的功能有 1 全血细胞计数功能 红细胞 白细胞和血小板计数及其相关的计算参数 2 白细胞分类功能 三分类或五分类白细胞百分率和绝对值 3 血细胞计数和分类功能的扩展功能 包括 有核红细胞计数 网织红细胞计数及其相关参数检测 未成熟粒细胞 幼稚粒细胞 造血干细胞计数 未成熟血小板比率 淋巴细胞亚型计数 细胞免疫表型检测等 6 血细胞分析仪检测原理一 电阻抗法二 射频电导法三 激光散射法 7 悬浮在电解质溶液中的血细胞相对于电解质溶液为非导电颗粒 其电阻比电解质溶液大 利用两者导电性能的差异 体积大小不同的血细胞 或类似颗粒 通过计数小孔时 可引起小孔内 外电流或电压的变化形成与血细胞数量相当 体积大小相应的脉冲电压 从而间接区分出细胞群 并分别进行计数 这就是电阻抗原理即库尔特原理 电阻抗法可精确测量出细胞 或类似颗粒 的大小 是三分类血细胞分析仪的主要应用原理 电阻抗法还与光学检测原理组合应用于五分类血细胞分析仪中 一 电阻抗法血细胞计数原理 电阻抗法细胞计算原理 8 二 射频电导法 射频指射频电流 是每秒变化大于10000次的高频交流电磁波 电导性即电的传送性能 高频电流能通过细胞壁 用高频电磁探针渗入细胞膜脂质层可测定细胞的导电性 提供细胞内部化学成分 细胞核和细胞质 如比例 颗粒成分 如大小和密度 等特征性信息 电导性特别有助于鉴别体积虽相同 但内部结构性质不同的细胞 或相似体积的颗粒 如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞两者直径虽均9 12um 但在高频电流检测时 因两类细胞不同核质比例而出现不同的检测信号 射频电导法结合其他检测原理一起应用于血细胞分析仪中 射频电流检测原理 9 三 激光散色法流式细胞术检测原理 将经试剂稀释 染色 球形化的细胞 或其他颗粒 悬液注入鞘液流中央 单个细胞随悬液和鞘流液两股液流整齐排列 以恒定流速定向通过石英毛细管 鞘流技术1 检测光 2 细胞流 3 前鞘流 4 后鞘流 5 流液方向 10 三 激光散色法流式细胞术检测原理 当细胞 或其他颗粒 通过激光束被照射时 细胞 或其他颗粒 因本身的各种特征 如体积大小 染色程度 细胞成分浓度或细胞核密度等 可阻挡或改变激光束的方向 产生与细胞 其他颗粒 特征相应的各种角度的散色光 置放在石英毛细管周围不同角度的信号检测器 光电倍增管 接受到特征各异的散色光 来自低角度散色光 或称前向散色光 的信息 反映细胞 或其他颗粒 的数量和表面体积大小 来自高角度散色光 或称侧向散色光 的信息 反映细胞 或其他颗粒 的内部颗粒 细胞核等复杂性 流式细胞术检测通道和光路系统 11 三 激光散色法流式细胞术检测原理 如细胞 或其他颗粒 用荧光染料染色 则染色后的细胞 或其他颗粒 被激光照射时 可产生不同波长的荧光散射 可用检测器接受散射荧光 将来自各种散射光的信息进行综合分析 即可准确区分正常类型的细胞 其他颗粒 激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时 比电阻抗法血细胞分群更准确 故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一 12 激光散射法系统基本组成 13 血细胞分析仪检测参数原理一 白细胞系列参数检测原理二 成熟红细胞系列参数检测原理三 血小板系列参数检测原理四 血红蛋白浓度测定检测原理 14 一 白细胞系列参数检测原理 15 1 流式细胞术 电阻抗 射频和特殊细胞染色法检测通道 1 4DIFF通道 利用激光流式细胞术 核酸荧光染色技术 采用专一溶血剂解红细胞和血小板 而白细胞膜仅部分溶解出现小开口 核酸荧光染料聚次甲基进入受损的白细胞内 与DNA RNA和细胞器结合 使之着色 染色后白细胞色深 未成熟粒细胞 异常细胞染色更深 成熟白细胞荧光染色浅 红细胞不染色 血小板稍染色 因荧光强度与细胞所含核酸量成比例 从而得到4DIFF白细胞散点图 包括中性粒细胞和嗜碱性粒细胞 淋巴细胞 单核细胞 嗜酸性粒细胞 百分率和细胞计数绝对值 和未成熟粒细胞 百分率和细胞计数绝对值 白细胞分类 4DIFF散点图 16 1 流式细胞术 电阻抗 射频和特殊细胞染色法检测通道 2 WBC BASO通道 在碱性溶血剂作用下 除嗜碱性粒细胞外的其他所有细胞均被溶解或萎缩 随后用流式细胞术计数嗜碱性粒细胞 从而得到WBC 嗜碱性粒细胞百分率和细胞计数绝对值及WBC BASO散点图 白细胞分类 白细胞 嗜碱性粒细胞散点图 17 1 流式细胞术 电阻抗 射频和特殊细胞染色法检测通道 3 未成熟粒细胞信息 IMI 通道 用射频 电阻抗和细胞化学染色法 在细胞悬液中加硫化氨基酸 幼稚细胞与硫化氨基酸结合的量多于较成熟的细胞 且对溶血剂有抵抗作用 因此 当加入溶血剂时 成熟细胞被溶解 只留下幼稚细胞 含未成熟细胞 原始细胞 造血祖细胞 得以计数 IMI通道可定量分析不同类型幼稚细胞 包括造血祖细胞 HPC 成熟粒细胞 原始细胞 异型 异常淋巴细胞 核左移和有核红细胞 得到HPC百分率和绝对值计数 未成熟粒细胞信息通道散点图 18 2 双流体 双鞘流 动力连续系统 DHSS 用钨光源流式细胞光吸收 化学染色和电阻抗法 白细胞计数通道 用电阻抗法检测 嗜碱性粒细胞通道 用专用染液染色 嗜碱性粒细胞具有抗酸性 而其他细胞胞质溢出 成为裸核 用电阻抗法检测 用电阻抗法检测 所得结果与白细胞 血红蛋白通道 采用鞘流阻抗法测定白细胞 的白细胞结果进行比较 嗜碱性粒细胞计数直方图 19 2 双流体 双鞘流 动力连续系统 DHSS 白细胞分类通道 双鞘流系统中 用流式细胞光吸收 电阻法和细胞化学染色液对细胞胞质和蛋白组分染色 检测除嗜碱性粒细胞以外的白细胞 在幼稚红细胞通道 荧光染色 进行白细胞分类 白细胞分类计数散点图 20 2 双流体 双鞘流 动力连续系统 DHSS DHSS技术 在流式通道中有2个鞘流装置 细胞经第1束鞘流后通过阻抗微孔测定细胞的真实体积 然后经第2束鞘流后到达光窗 测定细胞的光吸收 分析细胞的内部结构 双鞘流图 21 2 双流体 双鞘流 动力连续系统 DHSS DHSS技术 染色剂中含有溶血素及氯唑黑E活体染色 溶解红细胞 对单核细胞初级颗粒 嗜酸性粒细胞和中性粒细胞特异颗粒进行染色 同时对细胞膜 核膜 颗粒膜染色 得到中性粒细胞 单核细胞 嗜酸性粒细胞 淋巴细胞 异型淋巴细胞和巨大未成熟细胞 LIC 散点图结果 双矩阵LIC散点图可将幼稚细胞分为3个亚群 未成熟粒细胞 IMG 包括异常中性粒细胞 晚幼粒细胞 中幼粒细胞 早幼粒细胞 原始粒细胞 未成熟单核细胞 IMM 包括幼稚单核细胞 原始单核细胞 未成熟淋巴细胞 IML 包括幼稚淋巴细胞 原始淋巴细胞等 双矩阵巨大未成熟细胞 LIC 散点图 IMG未成熟粒细胞 IMM未成熟单核细胞 IML未成熟淋巴细胞 22 二 成熟红细胞系列参数检测原理 23 光学法检测网织红细胞 成熟红细胞和血小板散点图 1 电阻抗法依据红细胞大小和数量进行红细胞计数2 流式细胞术 鞘流电阻抗法红细胞 血小板计数通道 当红细胞计数你和血小板计数结果异常时 可提示转换至Ret PLT O光学检测通道 用光学法测定血小板 PLT O 得到与红细胞计数和血小板计数相关的众多参数 正常红细胞直方图 24 3 流式细胞术激光散射法 红细胞 血小板检测通道 用稀释液十二烷基硫酸钠 SDS 使红细胞 血小板成为球形并经戊二醛固定 红细胞被激光照射后 所得信号相同 且不影响MCV的测定 用低角度光散射测量红细胞体积与总数 高角度光散射检测单个血红蛋白浓度 可准确测定MCV MCH MCHC值 得到红细胞散点图 同时可测定单个红细胞体积及红细胞内血红蛋白含量 得到相应直方图及RDW HDW等参数 25 三 血小板系列参数检测原理 26 1 电阻抗法依据血小板大小和数量进行血小板计数 在电阻抗法血小板计数时 有的还采用3次计数 扫流和拟合曲线等计数准确性 2 流式细胞激光核酸荧光染色和电阻抗法红细胞 血小板计数通道 用鞘流电阻抗法测定血小板计数 PLT I 结果异常时 仪器转换至光学法核酸荧光染色网织红细胞 血小板检测通道 用光学法测定血小板 PLT O 核酸 DNA RNA 荧光染色时 未成熟网织血小板染色多 成熟血小板染色少 并显示PLT O散点图结果 可得到未成熟血小板比率 IPF 光学法血小板计数 PLT O 电阻抗血小板计数 PLT I 血小板比容 PCT 血小板分布宽度 PDW 血小板平均体积 MPV 大血小板比率 P LCR 成熟红细胞无DNA RNA 不被染色 从而得以在体积大小和核酸染色上与血小板鉴别 27 四 血红蛋白浓度测定检测原理 28 用光学比色原理测定血红蛋白浓度 有2类稀释液 1 改良氰化高铁血红蛋白法测定波长540nm 稀释液含氰化物成分 2 非氰化高铁血红蛋白法即稀释液不含氰化物配制的成分 如SLS Hb测定法 测定波长555nm 与手工法HiCN测定的相关性高 r 0 999 手工法HiCN反应时间长 仅用于仪器的校准 有些血液分析仪测定血红蛋白 可兼用非氰化物试剂 如用二甲基月桂胺氧化物 和氰化物试剂 如用咪唑 含氰化物试剂作用 但无毒性 29 检测参数 报警 30 1 报警的概念是指所检测的标本不能满足仪器软件系统的定义或不能满足实验室 用户 建立的检测标准 1 报警来源 主要有检测结果超出实验室设定的检测项目参考值 复检标准 临床疾病标本异常和患者人群变异 2 报警形式 主要有图片 符号或文字三种 仪器依据预先设定的检测数据 大小分布 图形等 作出全面分析和判断 对可以的阳性检测结果用文字或图示的形式作出解释性 易于理解的报警信息 如 用红色显示阳性 反之 绿色显示阴性 出现 阳性 或 错误 提示 可能确实是标本出现异常 因此必须根据实验室的规则 进一步仔细检查 特别须注意出现WBC DC RBC PLT及其相关参数的数量和形态异常的报警 31 3 报警有效性 仪器以参考方法检测结果作为标准 判断仪器检测性能指标 包括 灵敏度 S 特异性 Sp 阳性预测值 PPV 阴性预测值 NPV 和总数率 一致率或符合率 4 报警内容 仪器报警的项目和内容是厂商和用户作出的定义 内容涉及检测对象年龄 性别 参考值 危急值 红细胞计数值 血小板计数值 白细胞计数和分类值 细胞形态或可疑的各种异常信息 血细胞分析仪解释性程序 IP 是仪器依据检测数据 大小分布 图形的全面分析作出判断 提供易于理解的报警信息 用于对结果显示和信息的补充 提示浏览屏幕上报警信息 对同样的内容 各仪器报警形式并不统一 因此 要根据各仪器的操作手册 仔细理解定义 各类血细胞分析仪常见报警内容见表 32 血细胞分析仪常见报警内容 33 2 标本因素血细胞分析仪在检测性能上存在的共性问题是 在血细胞形态学方面 无论是白细胞五分类还是更多细胞分类 仍然不能替代人工显微镜检查对复杂的异常血细胞形态的识别能力 其原因除了血细胞分析仪检测技术上的局限性外 还受到疾病时标本中已存在的多种因素的干扰 34 标本干扰因素 35 标本干扰因素 36 临床应用 37 现代血细胞分析仪对生理状态下的血液细胞常规检测 包括白细胞分类 已经具备高度的检验精确性和准确性 在病理情况下 异常信息可见于现代血细胞分析仪异常的散点图 此时 应根据不同的病理信息 采用多种参考方法进行复查 值得注意的是 在显微镜复检上 少花人力 精力 过分信赖仪器或无视仪器显微镜复检的规则 将会导致临床对患者诊治的误导 因此 仪器检测结果的准确性来自临床的客观反馈和循证评价 目前 被批准用于临床的血细胞分析仪检测参数 包括传统手工检测的红细胞计数 血小板计数 白细胞计数和分类计数 百分率和绝对值 网织红细胞计数 百分率和绝对值 等为早有明确肯定的临床意义的参数 现代血细胞分析仪随着检测原理和技术的发展所开发的多种检测新参数 已经或正在经受实践的验证 以下简介新参数显示的独特临床应用价值 38 一 红细胞系列参数 红细胞体积分布宽度RDW反映红细胞体积大小不一致的程度 与MCV结合 对贫血分类诊断和鉴别有临床意义 Bessman提出了贫血的MCV RDW分类法 得到6类贫血 贫血MCV RDW分类法 39 二 血小板系列参数 血小板平均体积MPV反映血小板的平均体积大小 主要用于 1 鉴别PLT减低时的病因MPV正常或增高 见于骨髓增生功能良好而外血血小板破坏过多导致的血小板减低性疾病 如特发性血小板减少性紫癜 脾功能亢进 系统性红斑狼疮等 MPV正常或减低 见于再生障碍性贫血 MPV减低 见于骨髓病变引起的血小板减低如急性白血病 艾滋病等 2 评估骨髓造血功能恢复情况局部炎症时 骨髓造血受抑制 MPV可正常 败血症时 骨髓造血功能受抑制 MPV减低 白血病缓解时 MPV增高 如MPV和PLT持续减低 为骨髓造血衰竭征兆 MPV越小 骨髓受抑制越严重 骨髓功能恢复时 首先MPV增高 然后PLT逐渐增高 3 MPV与血小板功能关系胶原和凝血酶诱导的血小板聚集的速度及程度 随MPV增大而增高 有出血倾向者MPV显著低于无出血倾向者 40 二 血小板系列参数 血小板平均体积4 MPV PLCR和PDW有利于骨髓病性疾病 PDW正常或减低 与反应性血小板增多症 正常或增高 的鉴别 5 MPV和PLT两者呈非线性负相关