对化学性肝损伤的保护功能.doc

对化学性肝损伤的保护功能第三章 对化学性肝损伤有辅助保护保健食品的功效成分及检测一、概述肝损伤就是肝脏受到外界因素的入侵，从而引起的肝脏受损。肝损伤分为病理性肝损伤和化学性肝损伤。化学性肝损伤主要是由于化学药物中毒、过敏等引起，比如药物性肝炎、酒精肝、有机农药中毒等都会引起肝损伤、肝功能异常。（一）化学性肝损伤分类目前，化学性肝损伤以药物性和酒精性肝损伤最多见。1、药物性肝损伤由于药物及代谢产物的毒性作用或机体对药物产生过敏反应，对肝脏造成损害，引起肝组织发炎，即为药物性肝损伤。引起药物性肝损伤的药物主要有解热镇痛抗炎药、镇静催眠药、抗结核药、抗寄生虫药及某些抗菌药和激素类药物。药物导致肝损伤的机制包括：(1) 药物代谢产物形成氧自由基使脂质过氧化，引起肝损伤；(2) 部分药物经代谢产生亲电子产物，通过共价结合，损伤肝细胞膜和肝线粒体、微粒体膜，引起细胞损伤；(3) 药物代谢产生超氧化离子，促使脂质过氧化，导致肝细胞损伤。2、酒精性肝损伤酒精性肝损伤是指长期大量饮酒或含有乙醇的饮料造成的肝脏疾患,包括轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化。乙醇对肝脏的损害机理包括：(1) 乙醇进入机体后，约90%在肝脏内氧化，一条途径是在细胞质内经乙醇脱氢酶(ADH)氧化为乙醛，乙醛在线粒体内经乙醛脱氢酶(ALDH)作用氧化为乙酸。乙醇氧化的ADH途径会消耗大量的辅酶1(NAD)，使NAD+/ NADH比值变小，使三羧酸循环受到抑制，影响细胞能量供给。(2) 乙醇损害线粒体的功能，使线粒体脂质过氧化物增加，GSH水平下降，线粒体形态异常。(3) 乙醇氧化过程中的中间产物乙醛是高活性物质，当乙醛脱氢酶活性降低时，未被氧化的乙醛释放入血，通过黄嘌呤氧化酶变为超氧化物，导致脂质过氧化，破坏细胞膜，促进肝损伤。（二）化学性肝损伤的饮食治疗1、控制饮酒量，尽量饮用低度酒或不含酒精的饮料。2、调整饮食结构，提倡高蛋白质、高维生素、低糖、低脂肪饮食。3、增加维生素的供给，尤其是B族维生素。B族维生素 （包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、泛酸、叶酸等）和肝脏关系密切，缺少B族维生素，会导致细胞功能降低，引起代谢障碍。4、增加微量元素的供给。微量元素可维持身体组织器官与脏器的代谢，有助身体健康。5、多摄入富含微生态活菌的营养补充剂。微生态活菌可以通过调节肠菌群，抑制革兰氏隐性细菌繁殖，降低肠源性内毒素水平，有助肝脏排毒。 （三）对化学性肝损伤有辅助保护功能的保健食品目前，我国登记注册的“对化学性肝损伤的保护功能”的保健食品约260种，可分为以下情况：1、由中草药或其提取物研制而成。如灵芝、大豆、枸杞、茶、黄芪、芦笋、当归、山楂、银杏、香菇等，这类植物具有活血化瘀的、清肝解毒、强肝益肝的作用。主要功效成分有：多糖、黄酮类、甙类、萜类及木质素类化合物等，如粗多糖、葛根素、原花青素、银杏黄酮类、大豆皂甙、灵芝三萜、甘草酸、茶多酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲等，这些物质具有提高免疫能力、抗脂质过氧化、抗肿瘤、抗衰老等功效。2、具有抗氧化、促进细胞增殖、提高免疫力的营养物质。主要有腺苷、牛磺酸、甘草酸、硒、维生素E、维生素C等；3、一些特殊动物如牡蛎、毛虫干苦参、甲鱼、蚂蚁等提取成分制得。这类保健食品的具体功效成分还大多数不能确认。4、一些生物因子：胎盘因子、多肽等。这类保健食品过多借助生物工程或化学合成得来，对其是否应划入保健食品行列还存在一些争议，相关产品也少见。二、主要功效成分介绍（一）粗多糖1、结构与性质粗多糖是从大豆籽粒中提取出的可溶性寡糖的总称，大豆中的寡糖属于-半乳糖苷类，包括棉籽糖、水苏糖等。棉籽糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，为白色结晶粉末，密度1.465，熔点80oC，溶于水，极微溶于乙醇等极性溶剂，不溶于石油醚等非极性溶剂。水苏糖是由半乳糖、葡萄糖和果糖构成的非还原四糖。其结构式为：D-吡喃半乳糖基-1,6-D-吡喃半乳糖基-1,6-D-吡喃葡糖基-1,2-D-呋喃果糖苷，属于蔗糖的衍生产物，是棉子糖的同系物，分子式为C24H42O21，相对分子量666.59。2、生物学功能（1）促进双歧杆菌的增殖人体虽然不能直接利用粗多糖，但是粗多糖可被肠内细菌利用，并且能促进双歧杆菌的增殖。双歧杆菌是一种厌氧革兰氏阳性细菌，是维护和保持肠道菌群平衡的一个极为重要的因素，也是判断肠内外环境是否正常的一个可靠依据。（2）抑制病原菌粗多糖能促进双歧杆菌的增殖，从而抑制有害细菌如产生荚膜梭状芽孢杆菌的生长。双歧杆菌能发酵粗多糖产生短链脂肪酸和一些抗菌素物质，从而可抑制外源致病菌和肠内固有腐败细菌的生长繁殖。（3）防止便秘、腹胀，促进消化，调节胃肠功能肠道内的双歧杆菌发酵粗多糖产生大量的短链脂肪酸（主要是醋酸和乳酸），能刺激肠道蠕动，从而促进消化，防止便秘的产生。（4）增强免疫功能如果人较长期的食用无细菌食物，肠道就会因为缺少刺激而使其产生抗体的能力下降，从而容易诱发疾病。食用粗多糖，促进双歧杆菌的增殖，将对肠道免疫细胞产生刺激，提高其产生抗体的能力从而起到防治疾病的效果。 3、安全性观察大叶车前子粗多糖胶囊对小鼠的急性毒性反应。灌胃给予小鼠1日内最大质量浓度及最大体积的药量，观察急性毒性反应一周。试验小鼠最大耐受量为10.98 g/kg，相当于成人推荐剂量的343倍。试验小鼠毛色光洁，四肢活动、饮水均正常，鼻、眼、口无异常分泌物，未出现任何毒性反应。大叶车前子粗多糖胶囊毒性较低，安全性好，为临床治疗提供了一定的试验依据。（二）葛根素1、结构与性质葛根素（puerarin）别名普乐林、葛根黄素、黄豆甙元8-C-葡萄糖甙，是葛根的主要有效成份之一和标志成分。化学名为：8-D-葡萄吡喃糖-4,7一二羟基异黄酮。分子式C21H20O9，分子量为416.39。低含量时为棕色粉末，高含量为白色针状结晶粉末，熔点187188，溶于甲醇，微溶于乙醇、水，不溶氯仿和乙醚，结构见图1。图 1 葛根素结构式2、生物学功能葛根素是葛根中含量最高的主要有效成分，因此成为评估葛根类保健食品中的重要指标。具有增强心肌收缩力，保护心肌细胞作用。能扩张血管、降低血压、改善微循环。保护红细胞的变形能力，增强造血系统功能。具有抗血小板聚集，增加纤溶活性，降低血粘度作用。对肾炎、肾病肾衰竭均有保护作用。对非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫有明显的调节作用。可促进正常人和肿瘤病人的淋巴细胞转化率，增强自然素作用。对于干扰系统有明显的刺激和诱生作用。其主要化学成份为皂苷类化合物葛根黄酮。此外，葛根素对肝组织免疫损害具有保护作用，对突发性耳聋患者的甲皱微循环有改善作用，对缺氧心肌具有保护作用等功效。3、代谢动物实验表明，随着给药剂量的增加（35 mg/kg、75 mg/kg、370 mg/kg），药物的消除半衰期明显降低（分别为11.8 h、10.4 h、4.7 h）。体内分布以肝、肾、心脏和血浆中较多，睾丸、肌肉、脾脏次之，并可通过血脑屏障进入中枢。葛根素消除较快，在体内不易蓄积。4、安全性小鼠静脉注射葛根素，LD50为634.3 mg/kg，腹腔注射LD50为1412.2 mg/kg。 大鼠腹腔注射葛根素150 mg/kg、100 mg/kg，50 mg/kg连续5周，无积蓄性毒性，对心、肝、肺、脾、肾、肾上腺及肠等脏器无明显毒性。犬静脉注射葛根素，每日50 mg/kg、30 mg/kg、15mg/kg连续5周，再观察70天，对大小便常规、血常规、SGPT，BUN、血糖均无明显影响。健康成年SD大鼠实验，剂量为50、150mg/kg，对雌性大鼠胚胎及雄性大鼠生殖细胞均无致畸作用。致突变试验表明，葛根素没有潜在的致癌和致突变危险性。少数病人在用药开始时出现暂时性腹胀、恶心等反应，继续用药可自行消失。极少数病人用药后有皮疹、发热等过敏现象，立即停药或对症治疗后，可恢复正常。严重肝、肾损害，心衰及其他严重器质性疾病者禁用。有出血倾向者慎用。对葛根素有过敏或过敏体质者禁用。（三） 腺苷1、结构与性质腺苷（Adenosine）是核苷的一种，也是核酸的基本结构单位，全称为腺嘌呤核苷 (Adenosine)。由核糖（呋喃核糖）与腺嘌呤的一部分组成，中间由-N9-配糖键（-N9-glycosidic bond）连结。其化学名为9-D-呋喃核糖基腺嘌呤，其分子式为C10H13N5O4，分子量为267.24。腺苷为白色或类白色结晶性粉末，易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，结构见图2。图 2 腺苷结构式2、生物学功能腺苷广泛存在于动物的肝脏，以及冬虫夏草等生物体中，它具有参与人体代谢和生理调节的功能。腺苷可以舒张冠状动脉，调节冠脉血流；腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺 嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。腺苷在腺苷酶的作用下，生成腺嘌呤核苷酸，简称腺苷酸(AMP)，腺苷酸可作为多种辅酶(NAD、FAD、辅酶A等)的基本组成部分，对辅酶与特定酶蛋白的结合起重要作用，例如腺苷脱氨酶，它的缺失会引起免疫缺陷症。因此，腺苷对人体有着不可或缺的作用。随着人们对保健品的日益青睐，目前市场上已出现多种以腺苷为主要功能因子的保健品。3、代谢：腺苷是存在于几乎每个细胞内的一种内源性核苷。心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞都能迅速地合成、转运腺苷，参与腺苷的代谢，并调节细胞间质及血浆中的腺苷浓度。静脉应用腺苷后，血液循环中的腺苷主要是通过经细胞和血管内皮细胞的摄取，而被快速清除，半衰期10s。超生理量的腺苷可以被细胞外的腺苷脱氨酶通过脱氨作用降解。腺苷的激活和灭活都不需要通过肝脏或者肾脏代谢。4、安全性：腺苷的副作用（潮红、气急、胸痛）较常见，但多为一过性（12 min内消失）。对有窦缓或房室阻滞者慎用。由于腺苷的作用时间短，因此对血流动力学几无影响，较少引起低血压。腺苷与某些药物具有相互作用。治疗浓度的茶碱能阻断腺苷赖以发挥电生理和血流动力学作用的受体。双嘧达莫（潘生丁）阻断腺苷的摄取，从而使其作用增强。对正在服用这些药物的患者，应选用其它药物治疗。（四）五味子素1、结构与性质五味子素为木兰科植物五味子果实的提取物，主要有效成分为木脂素类如五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子丙素、五味子酯甲等。五味子素为棕色粉末，溶于氯仿、甲醇、丙酮、环己烷、正己烷等，不溶于水。五味子甲素(Schisandrin A)的分子式为C24H32O6，分子量416.51。五味子乙素分子式为C23H28O6，分子量为400.46。五味子醇甲的分子式为C24H32O7，分子量为432.51，五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲的结构见图3。图 3 三种五味子素的结构式2、生物学功能五味子素主要用于治疗肝炎、神经衰弱等症。具有抗氧化、保肝抗肝损伤、降低转氨酶及解毒作用。还具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的作用。(1) 避免肝脏受损：研究显示，五味子素有保护肝脏的作用。在中了四氯化碳毒的动物中，五味子素在改善肝脏功能方面起了很大的作用。(2) 促进肝脏细胞再生：在1992年，Kubo等学者指出动物在被切除部份肝脏后，五味子可以刺激肝脏的細胞再生。这是由于在早期的肝脏再生过程中，ODC这种酵素会参与其中，而五味子素正能增加ODC的活跃度，因而可以刺激肝脏的细胞再生。(3) 强化呼吸系统：五味子素能直接刺激在脑部的呼吸控制中心，从而增加呼吸的深度及次数。(4) 改善脑部机能：五味子素可直接改善神经系统。五味子素可以增强人的思考能力；在有神经衰弱问题(如疲倦、焦虑等)的动物身上，五味子可以使这些神经细胞正常化，从而改善神经衰弱的问题。(5) 其他功效：对循环系统，可以增强心脏肌肉收缩及血管舒张。对消化系统，可以调节胃液的分泌。对女性生殖系统，能够刺激子宫的收缩。3、安全性五味子可说是不带毒性的。在不同的临床测试中，五味子素都显示其极佳的耐药力。在实验中，即使老鼠服用大剂量 (5 g/kg)也不会致命。而如果连续10天让老鼠口服大剂量的五味子酒精抽取液 (5 g/kg)，也只是实验鼠身上发现轻微的中毒反应，如：减少活动量；但实验鼠的所有重要器官都沒有受到明显的影响。（五）甘草酸1、结构与性质甘草酸是甘草中最主要的活性成分，为白色或淡黄色结晶型粉末，无臭，有特殊甜味，其甜度约为蔗糖的250倍。易溶于热水和热的稀乙醇，不溶于无水乙醇和乙醚。分子式为C42H62O16，分子量为822.93，熔点220，结构见图4。图 4甘草酸结构式2、生物学功能甘草酸具有抗炎、抗病毒和保肝解毒及增强免疫功能等作用。甘草酸具有肾上腺皮质激素样作用，能抑制毛细血管通透性，减轻过敏性休克的症状。可以降低高血压病人的血清胆醇。由于甘草酸有糖皮质激素样药理作用而无严重不良反应，在临床中被广泛用于治疗各种急慢性肝炎、支气管炎和艾滋病。还具有抗癌防癌、干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂等功能。3、代谢无论通过静脉注射或口服给予甘草酸，甘草酸在体内代谢成甘草次酸而发挥作用，这一转化过程依赖肠道正常菌群水解，缓慢进行。静脉注射的甘草酸首先在肝细胞内由溶酶体中-D-葡萄甘酸酶代谢成3-单-葡萄甘酸甘草次酸，后者在肝脏中进一步代谢，随胆汁排入肠内，由肠内细菌代谢成甘草次酸，再吸收入血。甘草次酸在体外的活性较甘草酸强36倍，在体内强1015倍。4、毒性毒性小，对重要脏器无明显损害。少数患者服药后可出现浮肿，个别可出现胸闷、口渴、低血钾、轻度血压升高、头痛等不良反应，也有一例用药后引起精神症状的报道。以上症状停药后均可消失。（六）总三萜1、结构与性质根据三萜类化合物在植物体内的存在形式、结构和性质，可分为三萜皂苷及其苷元和其他三萜类（树脂、苦味素、三萜生物碱及三萜醇）两大类。角鲨烯是三萜类化合物的重要代表（见图6），是皂苷、羊毛甾醇等生物合成的前身72。图 5 角鲨烯结构式大多数三萜类(Triterpenes)化合物是一类基本母核由30个碳原子(含6个异戊二烯单位)缩合而成的萜类化合物，也是一类重要的中药化学成分。目前已发现的三萜类化合物，多数为四环三萜和五环三萜，少数为链状、单环、双环和三环三萜。三萜类化合物在自然界的存在形式有游离或者与糖结合成苷或酯的形式存在。游离三萜化合物不溶于水，可溶于常见的有机溶剂。三萜苷类易于水，其水溶液剧烈振摇时能产生大量、持久的肥皂样泡沫，故称为三萜皂苷。最为常见的是三萜皂苷，另外，三萜皂苷多具有羧基，所以又常称为酸性皂苷73。2、生物学功能三萜类化合物具有广泛的生理活性，通过对三萜类化合物的生物活性及毒性研究结果显示，其具有调节免疫力74、溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、护肝75、降低胆固醇、杀软体动物、抗生育等功效。其中，熊果酸(Ursolic acid)是重要的有待开发的新型五环三萜类药物。近年来，熊果酸及三萜同类物不断地被报道具有抗肿瘤、抗HIV、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、增强免疫功能和降血脂等效果。3、安全性角鲨烯是三萜类化合物的代表，以成人日摄入量的100倍（成人体重以60 kg计）作为最高剂量进行试验，灌胃30 d后的实验结果显示：角鲨烯对各试验组动物的机体无不良影响，各剂量组大鼠的体重及其增重、进食量、食物利用率、大鼠的脏体比与对照组比较差异均无统计学意义；血红蛋白含量、红细胞计数、白细胞计数及白细胞分类均在正常值范围内；血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白测定值均在正常值范围内。角鲨烯对机体未见不良印象，无副作用。三、检测方法综述1、粗多糖目前，我国对于保健食品中以粗多糖作为主要功效成分的检测目前尚无统一的法定标准，文献报道的方法有苯酚-硫酸法15、蒽酮比色法6、直接滴定法7、间接碘量法和高效液相色谱法等。蒽酮比色法对反应条件的要求较高，如温度、时间及蒽酮试剂的质量等级等。直接滴定法测定结果可能偏高，因淀粉等多糖对其有干扰作用。苯酚-硫酸法是将样品中水提醇沉沉淀下来的粗多糖在硫酸的作用下, 水解成单糖并迅速脱水生成糖醛衍生物, 与苯酚缩合成有色化合物。以葡萄糖或葡聚糖作为标准品,通过换算系数校正，比色测定粗多糖含量。沈向红1采用沸水浴加热2 h提取保健食品中的粗多糖，经无水乙醇沉淀高分子物质以去除水溶性单糖，再用碱性硫酸铜提纯后，以葡聚糖作标准进行苯酚硫酸显色。结果显示，当葡聚糖含量在0.00 mg0.10mgZ之间呈线性，对样品进行多次测定，批内相对标准偏差为1.01%4.95%，批间相对标准偏差为2.49%7.31%，加标回收率为91.80%100.4%。同时，该方法可可避免葡萄糖、果糖等单糖，蔗糖、纤维二糖、乳糖等双糖，淀粉、糊精等多糖及糖精钠对粗多糖测定的干扰。肖苏萍等2采用乙醇沉淀，苯酚-硫酸显色法，测定了保健饮料中粗多糖的含量。由于葡聚糖标准品价格昂贵，该方法采用葡萄糖标准品代替葡聚糖标准品，不再采用碱性二价铜试剂分离出具有葡聚糖结构的多糖，干扰因素较少。黄生权等3采用不同的测定方法测定真菌保健食品中的粗多糖的含量，考察标准品、提取方法、醇沉时间及显色方法等因素对多糖测定结果的影响。实验表明选用硫酸苯酚法进行显色，葡萄糖做标准品，超声功率250W, 超声提取30min, 醇沉10min, 测定结果较好。赵阳楠等8通过苯酚硫酸法和间接碘量法分别测定同一样品灵芝多糖的含量，两种方法测得总糖含量的结果基本一致，分别为2.04%和2.07%。两种方法均稳定可行。间接碘量法具有干扰少准确度高的特点，但与苯酚硫酸法相比，操作过程较为繁琐。钱一帆等9建立了灵芝孢子粉片中多糖含量的HPLC测定方法。采用Shodex SH1011(苯)乙烯二乙烯苯共聚物键合磺酸基)糖柱，流动相0.6%硫酸溶液，检测波长200 nm。灵芝孢多糖在0.25mg/mL8.00 mg/mL范围线性关系良好，平均加样回收率为102.73%，RSD=1.49%。2、葛根素目前，已报道的葛根素测定方法有分光光度法16、薄层扫描17、近红外光谱分析18、毛细管电泳19和高效液相色谱法1115。分光光度法是比较普及和实用的方法，但干扰大，影响测定结果；薄层扫描法具有试验费用便宜等优点，但只能作为半定量测定方法；近红外光谱分析法由于仪器的普及率不高，故方法的推广性不强；毛细管电泳法虽也是现在较为常用的检测方法，但定量较差。因此，目前测定葛根素的方法多为高效液相色谱法。刘泰然等11建立了胶囊、口服液、片剂、保健茶等保健食品样品中葛根素的高效液相色谱测定方法。以0.1%磷酸水溶液+乙腈（92+8）为流动相，Kromasil ODS (3.9 mm150 mm，5 m) 色谱柱，239 nm紫外波长下，外标法测定。葛根素的浓度在40g/mL200 g/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，加标回收率为92.1%102.2%，最低检出限为2 g/mL，相对标准偏差为3.5%。甘宾宾等14以甲醇+水（30+70，v/v）超声提取保健食品中的葛根素，采用DiamonsilTM C18(4.6 mm250 mm, 5m)色谱柱，甲醇+水(30+70，v/v)（用磷酸调节pH=3.0）为流动相，检测波长250 nm，建立了保健食品中葛根素含量的测定方法。方法的线性范围为3 ng 300 ng，平均回收率为99.7%，相对标准偏差为1.5%。杨振林等16采用薄层-紫外分光光度法测定葛根冲剂中葛根素的含量，以氯仿:甲醇:水（7:28:0.2）为展开剂，在紫外灯（365 nm）下定葛根素位置，在251 nm处测定吸光度来计算葛根素的含量。该方法印象因素较多，展开、刮下及洗脱过程可能会造成被测成分一定程度的损失，导致回收偏低。陈斌等18研究了优化分析葛根总异黄酮、葛根素和大豆苷含量数学模型的各种条件，包括建模样品集的选择、化学值的定标、测量的方法及条件，应用近红外光谱技术建立了快速检测葛根中有效成分的方法。但近红外光谱分析法由于仪器的普及率不高，方法的推广性不强。李存红等19建立了葛秦汤制剂中5种有效成分的非水毛细管电泳测定方法，研究了各种实验参数对分离的影响，如缓冲液浓度、分离电压、毛细管温度等。其中葛根素的线性范围为50.0 g/mL200.0 g/mL，检测限为0.121 g/mL，迁移时间和峰面积的相对标准偏差为1.4%和2.7%。、腺苷核苷为水溶性物质，其配糖体的羟基极性较大，在极性溶剂中溶解性好。对保健品样品中腺苷的提取，一般采用水、乙醇-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-缓冲盐水溶液等。提取的方式主要有加热回流提取、索氏提取、超声提取等，以超声提取的效果较好。腺苷的检测方法有高效液相色谱法2028、薄层色谱法29、离子色谱法30、毛细管电泳法31, 32、液相色谱串联质谱（LC-MS）法。HPLC是现在研究采用最多的方法，它具有分离效果好，无杂质峰干扰，线形范围宽等优点，也是国家标准最常使用的检测仪器。任一平等22应用反相高效液相色谱线性梯度洗脱法对中奇虫草胶囊、夕阳红胶囊等保健品样品中的腺苷进行了分离测定。采用水超声提取样品，使用Lichrospher 100RP-C18色谱柱，以pH4.55.5的磷酸二氢钾溶液和甲醇作流动相，在波长260 nm处检测，外标法定量。其标准曲线在1g/mL10g/mL的浓度范围内线性良好；加标回收率在103.5%105%之间。甘宾宾等23以水超声提取溶剂，超声提取30 min，对保健食品中的虫草素和腺苷含量进行了提取，采用高效液相色谱法测定，回收率在98.8%99.5%之间。薄层色谱-紫外分光光度法步骤繁杂，耗时较多。LC-MS作为一种联用技术为药物分析提供了新的手段，可以鉴别药物成分，在国外已有许多报道，国内受到条件限制，研究报道较少。离子色谱法是近年来发展较为迅速的定量技术之一，具有灵敏度高、重现性好、选择性好等优点，已广泛地应用于各个领域。脉冲安培检测器对于多羟基、氨基等化合物有着灵敏的感应。腺苷亦含有多羟基结构，在安培检测器上有相应。邹小莉等30建立了保健食品中腺苷的高效阴离子色谱测定方法。方法样品中的腺苷经乙腈-水提取后，以0.25 mol/L NaOH为流动相，采用Amino PACPA10氨基酸分离柱分离，Au为工作电极的脉冲安培检测器检测。腺苷在1.00g/mL 20.00 g/mL浓度范围内线性关系良好，样品平均加样回收率为93.3%106.7%，样品测定结果的RSD为8.86%。高效毛细管电泳法（HPCE）在药物分析的应用，已逐渐成为热点，其分析时间短，分离效率高，是高效液相色谱法（HPLC）的数十倍（一般可达每米几百万理论塔板数），检测限低，进样量小，溶剂消耗少，自动化程度高，但目前尚处于研究阶段。阮婧华等32探讨毛细管电泳法研究天然冬虫夏草用不同溶剂提取的效果及测定其中核苷及其碱基含量的可行性。采用Unimicro毛细管电泳仪，石英毛细管柱（60 cm75 m I.D.），运行缓冲液分别为36 mmol/L硼砂-15 mmol/L磷酸二氢钠（pH8.9），分离温度20，分离电压15 kV，测定波长254 nm，虹吸进样15 s。腺苷的平均回收率和RSD分别为96.4%和0.89%（n6）。4、五味子素对于保健食品及药品中五味子素，多采用环己烷、正己烷、甲醇作为提取溶剂进行提取，提取的方式主要有超声和索氏提取。测定方法主要有高效液相色谱法42-48、薄层层析-紫外分光光度法49、毛细管电泳法50。文献报道以高效液相色谱法为主，采用乙腈或甲醇和水为流动相，在254nm或224nm处检测45。袁军等43以甲醇为提取溶剂对舒肝糖乐胶囊中的五味子甲素进行提取，HPLC测定。五味子甲素在13g/mL137g/mL范围内呈良好线性关系，平均加标回收率为100.55%，RSD=0.61%(n=3)。谭生建等46以己烷超声提取肝复康丸中五味子甲素和五味子乙素，以乙腈-水（68:32）混合液（含0.2%磷酸，用三乙胺调pH5）作为流动相，使用LUNA-C18柱，五味子甲素和五味子乙素与其他成分分离良好，线性关系良好，平均加标回收率为100.5%和102.4%，RSD为1.5%和1.7%(n=5)。胡美山等45采用甲醇超声提取，建立了同时测定保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3种成分的高效液相色谱测定方法。色谱柱为Agilent zorbax SB-C18(4.6150 mm，5 m)，流动相采用甲醇-水进行梯度洗脱，检测波长为254 nm。五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的线性范围分别为0.21g 1.55g、0.28g 2.08 g、0.20g 1.51 g；加样回收率分别为97.48%、97.23%和97.88%（n=5）。李惠霞等49采用薄层扫描法测定复方降糖丸中五味子甲素的含量，五味子甲素在 0.753.75g线性关系良好，平均回收率为103.2%。毛细管电泳法具有高效、快速、微量等特点，在药物分析中得到了广泛的应用，在缓冲溶液中添加有机溶剂，可改善分离选择性。刘海兴等50采用毛细管电泳法，以磷酸氢二钠(15 mmol/L)、硼砂(15 mmol/L)和20%乙醇的缓冲液作为运行电解质溶液，获得了五味子甲素与五味子中其余成分的有效分离，准确地测定了五味子中的五味子甲素含量。五味子甲素的线性范围为0.030.37 g/L，相对标准偏差为2.63%（n=6），平均回收率为99.6%。5、甘草酸甘草酸作为甘草中的主要有效成分，在医药、食品、化妆品、卷烟等行业中有着极其广泛的应用。目前，文献报道的甘草酸的定量分析方法51主要有比色法、电化学方法、薄层扫描法、离子抑制色谱法、高效液相色谱法和高效毛细管电泳法。用于测定甘草酸含量的电化学方法主要有小波变换二次微分示波计时电位法52、极谱催化波法53。有近几年来，应用高效毛细管电泳法和高效液相色谱法定量分析甘草酸含量发展迅速。薄层扫描法是薄层色谱技术与光密度计和微型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。应用薄层扫描仪可同时对各种复杂的样品进行分离和测定。何桂霞等54采用薄层扫描法测定开胃健脾胶囊中甘草酸的含量。展开剂正丁醇-冰醋酸-水(6:1:3)上层液，测定波长 (s)为252 nm ，参比波长 (R) 500 nm。方法的线性范围为2.1g 10.5g，平均回收率为 98.94% ，RSD为1.35%。吴容军等55采用薄层扫描法测定术苓口服液中甘草酸的含量。平均加样回收率为 98.8%，精密度RSD=3.99%。 高效毛细管电泳法是根据组分在外电场条件下电泳淌度的差异而进行分离的一种新型分析技术，具有高效、快速、低耗、样品预处理简单等优点。祖元刚等56采用高效毛细管电泳法成功地分离测定了甘草中甘草酸的含量 ，在pH =5.8的50 mmol/L磷酸缓冲液，检测波长252 nm，分离电压25 KV ,进样压力20 mm汞柱，温度30 oC的检测条件下，标准溶液在 0.0448mg/mL0.224mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。对于甘草酸的测定，应用最为广泛的是高效液相色谱法，GB/T 22248-200857规定了保健食品中甘草酸的测定方法。根据甘草酸易溶于醇、水等极性溶剂的理化性质，不含油试样中的甘草酸采用流动相进行提取，对于含油试样则需用石油醚去油后再用流动相提取，过滤后进高效液相色谱仪，经反相C18色谱柱分离后，由紫外检测器检测。取样量3.0 g时，方法的检出限为1.010-3 g/kg，方法的定量限为3.010-3 g/kg，线性范围为5.0 g/mL 50 g/mL。何兵等58建立黄金咽喉片中甘草酸含量的高效液相色谱测定方法。采用的色谱柱为 Dikma Kromasil C18柱 (4.6 mm250 mm，5 m )，流动相为甲醇-0.2 mol/L醋酸铵-冰醋酸 (66:34:1)，检测波长为252 nm。甘草酸在0.4 g4 g范围内具有良好的线性关系，平均回收率为99.65%，RSD为0.514% ( n = 6)。方从容等59建立用反相高效液相色谱内标法测定保健食品中甘草酸含量的方法。该方法应用内标法测定保健食品中的甘草酸含量，甘草酸在20 g/mL300 g/mL范围内呈良好的线性关系，方法的回收率为87.2%96.7%，RSD为3.05%。6、总三萜对于保健食品及药品中总三萜，主要以乙醇、甲醇、乙酸乙酯为提取溶剂，其中选用乙醇为提取溶剂的文献较多，提取方式主要有索氏提取、超声提取81、回流提取76和浸提77。测定方法主要有分光光度法78,79、高效液相色谱法 76、高效液相色谱-质谱法80，文献报道以分光光度法为主。李宏杨等79以乙醇为提取溶剂，采用加热回流的方式提取苦丁茶中的总三萜。提取出的总三萜加入香草醛-冰醋酸、高氯酸显色，以熊果酸纯品为对照，在波长548 nm处用分光光度法测定苦丁茶中总三萜含量。陈颖等77以乙醇为提取溶剂，采用水浴浸提的方式，提取天花粉中三萜皂苷。选用熊果酸为对照品，香草醛-冰醋酸和高氯酸为显色剂，以紫外分光光度法测定天花粉中总三萜皂苷的含量。在16 g48 g范围内线性关系良好，加标回收率为97.22%，RSD=1.59%。陈太平等83采用高效液相色谱法研究细薄星芒海绵总三萜，使用的色谱柱为Pack-SIL分析柱（250 mm4.6 mm，5 m）；以正己烷（A）和乙酸乙酯（B）为流动相，梯度洗脱：030min A(75)，3035 min A(75%3% )，3550 min A(3% )；流速为1.0mL/min；检测波长为360 nm；柱温为室温。该方法建立的细薄星芒海绵总三萜提取物的高效液相色谱指纹图谱的特征性和专属性强。于能江等80以甲醇为提取溶剂，超声波提取茯苓粉末中三萜成分，以乙腈-水为流动相进行液相分离，二极管阵列(DAD) 和电喷雾质谱( ESI-MS) 两种检测方法在线检测。四、功效成分的检测方法（一）保健饮料中粗多糖含量的苯酚-硫酸法测定法21、测定步骤精密吸取保健饮料液体试样15 mL，加入无水乙醇60 mL，使含醇量达80%，充分搅拌混匀5 min，以3 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，低温烘干。残渣用水溶解并定容至250 mL，得供试品溶液。吸取供试品溶液2.0 mL，加入50 g/L苯酚溶液2.0 mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸8.0 mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸20 min，冷却后用分光光度计在485 nm处以试剂空白溶液为参比，1 cm比色皿测定吸光度值。根据标准曲线计算出葡萄糖含量，并计算该保健品饮料中水溶性粗多糖含量。2、方法特点方法的平均回收率为97.5%，RSD=1.96%。（二）层析-高效液相色谱法测定保健食品中葛根素的含量121、试剂和材料D101大孔吸附树脂：70%乙醇浸泡24 h，充分膨胀后，反复用去离子水冲洗，将乙醇洗净后装柱；层析柱柱高为10cm，长15cm，内径1.0 cm。2、测定步骤（1）单一葛根提取物制成的试样根据试样含量，称取0.50 g1.00 g试样（精确至0.001g），加适量70%甲醇，超声提取20 min，冷却至室温，再用70%甲醇定容至10mL，混匀，静置，上清液经0.45 m滤膜过滤后，用液相色谱分析，外标法定量。（2）多种植物提取物制成的试样：需经大孔树脂净化后再进行高效液相色谱分析。根据试样含量，称取0.50 g1.00 g试样（精确至0.001 g），加适量水溶解，超声提取20 min,冷却至室温后用水定容至10 mL，混匀，4000 r/min离心5 min。取1 mL上清液上大孔吸附树脂层析柱，用约40 mL水以1 mL/min淋洗杂质，再用50 mL 70%甲醇洗脱葛根素，将洗脱液置于沸水浴蒸发近干，用70%甲醇将其溶解并定容至至1 mL，过0.45 m滤膜后，用液相色谱分析，外标法定量。色谱条件：高效液相色谱仪配紫外检测器；色谱柱：ODS C18柱（250 mm4.6 mm i.d.，5 m）；流动相：甲醇+36%乙酸+水（25+3+72）；流速：0.6 mL/min；检测波长为247 nm；。葛根素标准溶液和多种植物提取物制成的试样色谱图见图7。3、方法特点当取样量为1.0 g，定容体积为10mL时，以信噪比S/N=3计算方法的检出限（LOD）为2.010-5 g/kg；当取样量为1.0 g，定容体积为10 mL时，以信噪比S/N=10计算方法的检出限（LOQ）为6.010-5 g/kg。葛根素在 5.0 g/mL 50.0 g/mL内呈线性关系, 方法的回收率为81.6%100.2%，试样测定RSD为0.84% 1.08%。图 6葛根素标准溶液和多种植物提取物制成的试样色谱图（三）保健食品中腺苷含量的测定1、测定步骤取适量样品用研钵研磨混合均匀，盛于清洁密闭容器内标识后作为试样。准确称取试样约0.5 g(精确到0.1 mg)于50mL烧杯中，加入15 mL甲醇溶液（1+1，V/V），于混匀器上稍加混匀后，置超声波清洗器中超声30 min，取出后冷却至室温，转移至25mL容量瓶中，并用甲醇溶液（1+1，V/V）稀释至刻度。取少量溶液于离心管中，离心15 min，取1.0 mL上部清液于10 mL容量瓶中，甲醇溶液（1+1，V/V）定容至刻度，取适量溶液用微孔过滤器过滤，供液相色谱测定，外标法定量。色谱条件：高效液相色谱仪配紫外检测器；色谱柱用C18（250 mm4.6 mm i.d.，5 m）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液（15+85，V/V）；检测波长：260 nm；柱温为35；流速：0.6 mL/min。2、方法特点在方法所确定的实验条件下，在1.0 g/mL10 g/mL浓度范围内，腺苷的线性关系良好。以S/N=5确定测定低限（LOQ）为0.01%，该测定低限能满足市售保健食品中腺苷含量要求。选用腺苷含量分别为0.00898%和0.249%两个发酵虫草菌粉样品，进行添加回收试验，方法的总体平均回收率在86.7%106.8%之间，总体平均相对标准偏差在1.22%6.08%(n=6)之间。（四）保健食品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量测定451、测定步骤精密称取样品（市售含五味子类保健食品）细粉0.5 g，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量，超声处理30 min，放至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀后过滤，即得到供试品溶液，供液相色谱测定，外标法定量。色谱条件：Waters Alliance 2690高效液相色谱仪配DAD紫外检测器；色谱柱为Agilent zorbax SB- C18 柱(150 mm4.6 mm i.d.，5 m)；流动相：甲醇-水梯度洗脱（30min内甲醇比例由65%递增到85%）；流速：1.0 mL/min；检测波长254 nm。标准溶液和样品色谱图见图8。2、方法特点五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素分别0.21 g 1.55 g、0.28 g 2.08 g、0.20 g1.51 g范围内线性关系良好。以S/N=3为标准测得最低检测限分别为五味子醇甲0.03 g、五味子甲素0.08 g和五味子乙素0.06 g。加样回收率分别为97.48%、97.23%和97.88%（n=5）；同一样品5次平行提取并测定的RSD分别为0.89%、0.93%和1.07%。图 7 标准溶液和样品色谱图（五）保健食品中甘草酸测定方法的研究591、试剂材料甘草酸对照品溶液: 精确称取甘草酸对照品 10 mg，用甲醇溶解定容至 10.0 mL，摇匀。对-羟基苯甲酸丁酯溶液: 精密称取对-羟基苯甲酸丁酯10 mg，加甲醇定容成1 mg/mL的溶液, 作为内标储备液。2、测定步骤片剂或粉状胶囊试样：称取0.5 g3.0 g均匀试样，准确到0.001 g，置于50 mL容量瓶中，准确加入0.5 mL内标储备液，然后加入约40 mL 50%甲醇，超声提取30 min后，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，3 000 r/min离心10 min，过0.45 m滤膜，供高效液相色谱测定，内标法定量。口服液试样：准确吸取5.0 mL 10.0 mL试样于50 mL容量瓶中，准确加入0.5 mL内标储备液，然后加入约40 mL 50%甲醇，超声提取30 min后，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，3000 r/min离心10 min，过0.45 m滤膜，用高效液相色谱测定，内标法定量。色谱条件：Waters 2695高效液相色谱仪配紫外检测器；色谱柱为ODS C18柱 (4.6 mm150 mm，5 m)；流动相：3%醋酸溶液+乙腈( 60+40)，内标物为对羟基苯甲酸丁酯，检测波长：254 nm。对照品和试样色谱图见图9。3、方法特点以甘草酸与内标峰面积比为纵坐标，以浓度为横坐标进行回归甘草酸在20g/mL 300 g/mL范围内呈良好的线性关系，方法的回收率为87.2%96.7%，RSD为3.05%。图 8 对照品和试样色谱图（六）分光光度法测定灵芝孢子粉中总三萜含量821、测定步骤称取灵芝孢子粉胶囊约1 g，用乙酸乙酯溶解，超声震动30 min，用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液5 mL定容至50 mL作为供试品溶液。吸取1.00 mL供试品溶液于100水浴上蒸干后，加入5香草醛-冰醋酸溶液0.40 mL和1.00 mL高氯酸，65水浴加热45 min后移人冰水浴中，再加入5.00 mL冰醋酸，摇匀后置于室温。15 min后用紫外/可见分光光度计于548.1 nm波长下测定样品溶液的吸光度。2、方法特点熊果酸含量在0.022 mg0.130 mg范围内呈良好的线性关系；加样回收率为101.71%11 6.16%，均值为108.94% ，RSD为5.24%。称取同一灵芝孢子粉胶囊内容物，平行测定6份，RSD为1.59 %。（七）保健食品中水飞蓟素的含量测定方法HPLC法水飞蓟是用于治疗肝脏疾病的常用药物，其主要有效成分是水飞蓟素，属于黄酮醇类物质，包括水飞蓟宾，异水飞蓟宾，水飞蓟宁，水飞蓟亭等。药理作用表明水飞蓟素主要是通过限制ROS（reactive oxygen species）的活性来实现其治疗作用的。现行国家标准采用紫外分光光度法 ,以水飞蓟宾计算水飞蓟保健品中水飞蓟素的含量，测定结果是水飞蓟素 (总黄酮 )的含量，结果受颜色变化等因素影响较大，并不能准确测定水飞蓟宾的含量。为了进一步研究该类保健品的药理作用，同时对该类制剂的质量进行监控，非常有必要建立一种针对水飞蓟保健品中的水飞蓟素的分析方法。本方法建立了保健品中水飞蓟宾含量测定的高效液相色谱法，采用水飞蓟宾的两种异构体的色谱峰面积之和计算其含量，该方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点 ,可用于该类产品的有效成分水飞蓟素的含量测定和质量控制。1、测定方法（1）提取取某保健品片剂20片，研碎混匀后取1g用25ml甲醇溶解，用超声波辅助提取15分钟，然后用3000 r/min的转速离心5 min。为了提取完全，提取过程重复一次。提取溶液转移至50ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度。取2ml样品溶液经0.45m膜过滤，供HPLC分析。（2）色谱分离条件的优化水飞蓟素的结构式见图3所示。在色谱柱选择方面，比较了日本岛津Shim-pack VP-ODS柱（250 mm4.6mm, 5m）和大连江申Spherigel C18柱，结果表明shim-pack VP-ODS柱有较好的分离效果，并且峰形也较好。流动相我们考察了甲醇和不同添加剂的水溶液，结果表明甲醇和磷酸二氢钠缓冲液梯度洗脱有较好的色谱分离效果，流动相最终选择为：流动相A为甲醇水0.2mol/L磷酸0.5mol/L磷酸二氢钠= 80:120:1:8，流动相B为甲醇，梯度洗脱；流速：1.2 mL/min；检测波长：280 nm ；柱温：30 。实验结果表明，在表8所示的梯度条件下，可以获得满意的分离效果（图4）。图 9 水飞蓟宾的异构体(Silybin)表 1 流动相梯度表时间（min）A%B%0.0110005.00802024.00752535.00653555.00455560.00结束图 10水飞蓟宾标准品的色谱图（峰3为水飞蓟宾A, 峰4为水飞蓟宾B,两种异构体可以很好的分离）3、方法的线性范围与检测限逐级稀释水飞蓟宾标准工作液至10、20、40、60、80、100g/ml浓度进行测定，以水飞蓟宾的2种异构体的紫外响应峰面积之和（Y轴）对相应的水飞蓟宾的浓度（X轴）作图，定量分析水飞蓟宾的检测波长为280nm；本方法在10g/m100l范围内呈线性，结果表明，紫外响应峰面积和样品浓度之间有很好的线性关系，检测限（S/N=3）的范围为2 ng/ml。4、方法的回收率与精密度选用不含水飞蓟宾的阴性控制样品，按2002/657/EC要求每个添加浓度水平取6个平行样品，进行3浓度水平添加回收试验，本方法的平均回收率为：94.5%95.8%，室内相对标准偏差为：2.82%6.38 %。参考文献1 沈向红. 保健食品中粗多糖测定方法研究. 食用预防医学, 2001, 8(6): 461-462.2 肖苏萍, 吴剑威，曹韧楠，周琳，陈波. 苯酚-硫酸法测定保健饮料中粗多糖含量方法研究. 中国现代中药, 2008,10(7): 37-38. 3 黄生权, 敖宏, 郭爱玲. 真菌保健食品中多糖含量测定的比较. 现代食品科技 2010, 26