脉冲场电泳.doc

脉冲场凝胶电泳 - 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。22000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。3稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。4用PBS重悬细胞，以达到40l PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10g）5用PBS配制2浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50。6将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。7静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。8将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50保持23天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。9蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4。10此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。11将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4保存凝胶块。13若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min2次。脉冲场凝胶电泳 - 大小标准物的制备多联体1以TE缓冲液悬浮多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4g/40l。2用等体积TE配制的2低熔点琼脂糖（温度保持在45）混匀。3移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。4室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。酵母染色体1从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡2448h（产量大约100块）。24000g转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。3仍以4000g转速离心10min，再用SCE【1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/LEDTA (pH7.5)】溶液重悬。4取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。5溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40l SCE溶液中含5107个细胞（相当于80l体积的模块中含有5107个细胞）。6溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/L-巯基乙醇混匀，37保温1530min。7细胞悬液与等体积的SCE配制的2低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50。8将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。9凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37下振荡温育12小时。10将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50温育48h。11用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次，每次20min。12. 凝胶块可用此混合液于4保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。脉冲场凝胶电泳 - 琼脂糖凝胶块中DNA的限制性内切酶消化1应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。2在Falcon试管中用1TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。3混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），1020单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10g DNA。4设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA降解。5将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。6若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求50条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。7若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。脉冲场凝胶电泳 - 凝胶电泳1.将0.8的琼脂糖在0.25TBE中熔化后冷却至5060，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。2.凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。3用1液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25TBE配制）密封狭槽。4若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。5一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。6应设定合适的电压及转换时间（参考分子医学技术84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。7电泳结束后，凝胶用0.25TBE配制成的EB（0.4g/ml）染色。8用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。9凝胶成像：DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。10.用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min，让D