枣庄市新城疫流行病学调查(定稿2).doc

枣庄地区鸡群新城疫流行病学调查张春岭1,2（1.山东农业大学动物医学院，泰安271018 2.枣庄学院，枣庄 277160）摘要：采用常规流行病学调查方法，对枣庄市6个地区13个肉鸡群和13个蛋鸡群的ND进行了流行病学调查，结果发现，13个疑似ND肉鸡群的发病日龄一般在7-49日龄之间，发病率、死亡率分别为35%-90%和35%-68%；13个蛋鸡群的发病日龄在70-480日龄之间，发病率、死亡率和产蛋下降率分别在10%-60%、3%-18.7%和10%-50%之间；不同品种的鸡均可发生；肉鸡以冬季多发，蛋鸡以春、秋季多发。通过SPF鸡胚接种和血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI），从26个疑似鸡ND的病鸡群中分离到了20株NDV，其中12株为强毒株，5株为中等毒株，3株弱毒株。用分离的NDV株感染30日龄非免疫鸡，发现发病率为100%，病死率在75%-100%之间，临床症状、病理变化与自然发病鸡相同。并通过流行病学调查，初步探明了枣庄地区鸡场发生ND的原因。 关键词：新城疫；鸡群；流行病学调查；病毒分离新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Viruse，NDV）引起的鸡的一种烈性传染病，给我国禽业养殖带了巨大的经济损失。近年来，在我国虽然没有大规模暴发ND，但不同地区的局部流行或散发时有发生。在长期高强度的NDV疫苗免疫压力下，ND发病呈现特殊变化，主要是免疫失败现象逐渐增多；感染宿主扩大，对水禽致病力增强；NDV毒力发生了变异，不管人工传代还是自然选择，NDV的毒力均可能由弱变强，并且毒力的演化速度明显在加快1。这无疑对传统的ND免疫预防提出了严峻的挑战。本试验采用常规的流行病学调查方法，对枣庄市6区的主要养鸡场的26个鸡群（肉鸡、蛋鸡各半）的ND进行了较系统的调查，基本摸清了该病在枣庄地区的流行状况，并分离获得了20株NDV；该研究结果为枣庄地区养鸡场有效控制ND的发生流行提供了理论依据和技术支撑。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料 采自枣庄5区（市中区、薛城区、峄城区、台儿庄区和山亭区）、1市（滕州市）的13个肉鸡群和13个蛋鸡群中患病或死亡的疑似ND病鸡的脑、肝脏、肺脏、血液等样品。1.1.2 ND标准阳性血清 ND La Sota株标准阳性血清（HI效价为210），本研究室保存；禽流感（H9和H5）单因子标准阳性血清及EDS-76标准阳性血清，均由中国农业大学试验动物研究所病毒室惠赠。1.1.3 鸡胚与鸡 10日龄SPF鸡胚、1日龄SPF鸡和SPF种蛋，均购自山东省农科院家禽研究所SPF鸡研究中心；6周龄及30日龄非免疫鸡，购自枣庄某鸡场。1.1.4主要仪器设备 FA1104型电子天平(上海)；二氧化碳培养箱（Forma公司）；CH20生物光学显微镜（Olympus Optical Co. Led. Japan）；SW-CJ-IF净化工作台（江苏苏净集团苏州安泰空气技术公司）；96孔微量V型反应板（艾本德中国有限公司）。1.2 方法1.2.1 ND流行病学调查 采用常规流行病学调查方法，对枣庄市6个地区的26个疑似ND的病鸡群的发病日龄、发病季节、发病率、死亡率及产蛋下降率等流行状况进行了调查，记录、处理数据，并对发病原因进行了调查分析。1.2.2病毒的分离 （1）病料的采集与处理。自枣庄市6个地区26个疑似鸡ND的病鸡群中无菌采集病、死鸡的脑、肝脏、肺脏等样品，每群随机采30只，-20保存备用；同时从每群尚无症状或发病不超2 d的鸡中采集10份血样，收集血清4保存备用2。将上述病鸡的脑、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等组织剪碎、研磨后冻融3次，加5倍灭菌生理盐水，混匀，加入双抗(青霉素、链霉素)，使其终浓度达到2000 IU/mL，置4冰箱中作用2 h，取上清，5000 r/min离心20 min，取上清，用细菌滤器过滤，取过滤液-20保存备用。（2）鸡胚接种。取上滤液，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，0.2 mL/枚，同时取10枚接种灭菌生理盐水作对照。石蜡封孔，37孵育，弃去24 h内死亡的鸡胚，以后每4 h照蛋1次，及时收集死胚，4冷却24 h，无菌收集鸡胚尿囊液，作细菌检样后放-20保存备用，并观察鸡胚的病理变化。1.2.3病毒的鉴定 （1）血凝试验（HA）：收集24 h以后死亡鸡胚及96 h内活胚的尿囊液用微量法进行血凝试验，即：先在96孔V型反应板的横排12个孔中各加入50 L生理盐水，然后取50 L尿囊液于第一孔中混合，后吸出50 L至第二孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去50 L，12孔为生理盐水对照孔。然后向每孔加1%鸡的红细胞50 L，振荡1 min，室温作用30 min，观察并记录结果。（2）血凝抑制试验（HI）：将上述具有凝集鸡红细胞能力的鸡胚尿囊液按其HA效价配成4血凝单位分离毒。按微量法用NDV标准阳性血清进行血凝抑制试验。（3）禽流感、EDS-76阳性血清中和试验：将结果为阳性的鸡胚尿囊液按HA效价配成4单位分离毒，再用禽流感(H9、H5)标准阳性血清、EDS-76标准阳性血清分别作HI试验。（4）新城疫病毒分离株的毒力测定：鸡胚最小致死量平均死亡时间（MDT）测定：将检测鸡NDV为阳性的尿囊液用灭菌生理盐水作10倍递增稀释，每个稀释浓度分别通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚，0.l mL/枚，37孵育7 d，弃去24 h内死亡的鸡胚，以后每天照蛋4次，记录每组中各胚死亡时间。取致全部鸡胚死亡的尿囊液最高稀释度对应的死胚记录，按中华人民共和国兽用生物制品规程3计算MDT，计算公式：MDT=（x小时 x小时死亡鸡胚数 + y小时 y小时死亡鸡胚数 + z小时 z小时死亡鸡胚数 + ）/ 死亡鸡胚总数。一日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）测定：将检测鸡NDV为阳性的尿囊液用灭菌生理盐水作10倍递增稀释，每个稀释浓度分别脑内接种l日龄SPF雏鸡10只， 0.05 ml/只，取10只SPF鸡注射灭菌生理盐水作对照。试验组与对照组鸡隔离饲养，每日观察2次，连续观察8 d。每天观察时计分：正常鸡得0分，患病鸡得1分，死亡鸡得2分。根据每日的记分，按下列公式计算ICPI3。ICPI=（8d累计发病数l十8d累计死亡数2）/ 8d内累计观察鸡数。六周龄鸡静脉注射致病指数（IVPI）测定：将检测NDV为阳性样品尿囊液用灭菌生理盐水作10倍递增稀释，每个稀释浓度分别翅静脉接种6周龄非免疫鸡10只，0.1 mL/只，取10只鸡注射同等剂量生理盐水作对照。将试验组和对照组鸡隔离饲养，每日观察2次，连续观察10 d。每日观察时计分：正常得0分，发病鸡得1分，发病得2分，死亡得3分。根据得分按下列公式计算IVPI3。IVPI=（10 d内累计死亡数3+10 d内累计瘫痪数2+10 d内累计发病数1）/10 d内累计观察鸡只总数。（5）NDV分离株人工感染试验：取30日龄ND非免疫鸡210只，随机分成21组，10只/组。将1-20组分别用分离的NDV液（分离株尿囊液作10倍稀释）肌肉注射0.l mL/只，第21组注射灭菌生理水作对照。严格隔离饲养，每日观察2次，连续观察15 d，并记录鸡的发病及死亡情况，及时无菌采集死亡鸡的病料，用于病毒的回收试验。2 结果2.1 鸡群的流行病学调查对枣庄市6地区的疑似ND的13个肉鸡群、13个蛋鸡群的流行病学调查结果见表1、表2。表1 枣庄市不同地域13个疑似ND肉鸡群的发病情况统计地域品种发病日龄鸡群数量（只）发病季节发病率（%）死亡率（%）1-11-22-12-23-13-24-14-24-34-45-15-26-1AA艾维茵817AAAA艾维茵艾维茵肉杂AAAA三黄鸡AA麻鸡104271422202045204927218300019003210187022002680489028007800586098064253210春季春季冬季冬季秋季秋季冬季冬季冬季冬季春季春季秋季90409034506040302016304585618357.81099.9647101368注：1 市中区，2 山亭区，3 台儿庄，4 滕州市，5 薛城区，6 峄城区表2 枣庄市不同地域13个疑似ND蛋鸡群的发病情况统计地域品种发病日龄鸡群数量（只）发病季节发病率（%）死亡率（%）产蛋下降率 （%）1-31-41-52-32-43-33-44-55-35-46-26-36-4海兰褐罗曼罗曼海兰褐海兰灰农大3号海兰褐海兰褐罗曼褐海兰褐农大3号海兰褐海兰褐70321422350288450380120903002404801803700225030002500450070002880185040001800330038601600春季春季春季冬季冬季秋季秋季冬季春季春季秋季秋季秋季4020351810153045605030252018.74.54.832.33513.4126.253.810.5/304025401350/42352210从表1、2结果显示，肉鸡群的发病日龄一般在7-49日龄之间、蛋鸡群在70-480日龄之间，其中7-10日龄的肉鸡群发病率在85%-90%之间，死亡率在35%-68%左右；13个蛋鸡群的发病率、死亡率和产蛋下降率分别在10%-60%、3%-18.7%和10%-50%之间；不同品种的鸡均可发生；其中肉鸡以冬季多发（6群/13个鸡群），蛋鸡以春、秋季多发（5、5群/13个鸡群）。2.2 新城疫的发病原因分析从20个ND确诊鸡群分析发现，ND发生的原因有以下几种：（1）发病鸡场存在环境卫生差、鸡舍分布密集，舍与舍之间的距离太近的弊端。另外，鸡舍简陋，消毒不彻底、没有灭鼠和杀虫意识、鸡只饲养密度大、通风不良、有害气体浓度超标等也是造成发病的重要原因。（2） 发病鸡场多是半封闭式饲养，很难预防其它鸡群NDV强毒的传入；养殖场对不同来源地鸡并未分开饲养，造成不同疾病的混合感染。（3） 管理人员缺乏兽医知识，在饲养区剖解病死鸡，对病死鸡缺乏严格隔离和及时淘汰制度；对进入养殖场的车辆和人员来往控制不严格；免疫程序不合理，具有随意性；消毒制度不健全。2.3鸡胚接种 鸡胚接种后，2864 h内全部死亡，死亡胚体全身弥漫性出血，尤其是胚的头部、颈部和脚爪出血严重，形成紫红色出血斑，肝脏点状出血斑和坏死灶。采集的尿囊液经细菌检验为无菌。2.4 病毒鉴定结果血凝试验（HA）和血凝抑制实验（HI）结果发现：26份被检样品中，有23份尿囊液对鸡红细胞发生凝集（占样品总数88.5 %）。23份中有20份被ND阳性血清所抑制。但23份检样均不能被禽流感及EDS-76阳性血清所抑制。2.5 NDV分离株毒力测定结果对分离的20株NDV分别进行了MDT、ICPI和IVPI毒力指标测定，结果见表3。表3 新城疫分离株毒力测定结果分离NDV毒株代号MDTICPIIVPI1-1511.702.431-3451.892.51-4661.031.451-51200.202-2481.822.62-3451.872.52-4511.852.83-1621.41.453-3481.822.703-4144004-1331.602.504-2471.822.544-41030.405-1581.61.455-2471.702.905-3361.822.455-4781.20.46-1451.702.566-2680.950.46-4451.872.90由表3结果发现，根据国内比较公认的毒力分类标准（MDT在30-60 h之间、ICPI在1.6-2.0之间和IVPI在2.0-3.0之间为强毒株；MDT在60-90 h之间、ICPI在0.6-1.5之间和IVPI在90 h、ICPI在0-0.5之间和IVPI在2.0为弱毒株）。分离的20株NDV毒株，有12株强毒株，5株中等毒力，3株弱毒株。2.6 NDV分离株人工感染试验结果人工感染30日龄非免疫鸡后，均有发病及死亡现象，发病率均为100%，死亡率为0%-100%不等，对照组鸡未发病，全部健活；发病鸡多数在第3-4d开始表现精神沉郁，羽毛蓬乱，喜卧，饮食欲下降，排黄绿色粪便，有呼吸道症状；第5-6d开始有死亡，剖解发现：病鸡喉头、气管出血，腺胃乳头充血，出血，十二指肠、空肠、回肠淋巴滤泡处粘膜肿胀、充血、出血或坏死溃疡，盲肠扁桃体充血、出血、坏死；其它器官也有不同程度的出血。3 讨论近年来，在养鸡场中ND不断发生流行，给养鸡业造成了巨大的损失。为了探明枣庄市鸡群ND的发生流行状况，对枣庄地区26个鸡群的ND进行了流行病学调查，并从疑似鸡ND的病鸡群中，分离到了12株NDV强毒株，5株中等毒力株，3株弱毒株。NDV可以通过饲养员、饲料、饮水、空气灰尘和鸟类传入，其中野鸟在ND的发生和流行中有不可忽视的作用4。本次流行病学调查发现，发病鸡场多是半封闭式饲养，鸡场消毒措施不健全，没有灭鼠和杀虫措施，对进入养殖场的车辆和人员来往不加控制，野鸟尤其是麻雀在鸡场、鸡舍、饲料场穿梭频繁。由此可见，作为与饲料厂、鸡场接触密切的麻雀等野鸟，在鸡ND的传播中发挥了重要作用，而防止野鸟尤其是麻雀、鸽子等对NDV的传入是饲料厂、养鸡场今后一项十分重要的任务。由于疫苗接种的普及，ND的流行在我国一度得到控制，但目前仍有发生，陈美足5调查鸡群免疫失败时强调，疫苗质量不佳、疫苗运输或保存不当、疫苗稀释液不符合要求、免疫接种时机不当、接种剂量不准确、接种方法不当等是造成免疫失败的主要原因。本次调查发现，管理人员缺乏兽医知识，对病死鸡缺乏严格隔离和及时淘汰制度，免疫程序不合理，且具有随意性，对疫苗稀释不符合要求等也是造成ND发生流行的重要原因。