发酵工程实验讲义2010129.doc

发酵工程实给讲义-10升发酵罐的分批发酵实验目的通过本实验加深对发酵罐结构原理和分批发酵原理的认识，了解工业发酵的基本工艺和方法并掌据相关发酵参数的测定方法。实验原理 一、分批发酵原理分批发酵是一种准封闭式系统，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在生物反应器内，在此简单系统内所有液体的流量等于零。它的一个显著特点是培养基一次性加入，产品一次性收获，分批发酵是目前广泛采用的一种发酵方式。分批发酵过程一般可以粗分为四期：停滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。停滞期，即刚接种后的一段时间，细胞数目和菌量不变，因菌对新的生长环境又一适应过程，其长短主要取决于种子的活性、接种量和培养基的可利用性和浓度。当细菌已经适应新的环境，养料充足而又无抑制生长的物质，便进入对数生长期，其比生长速率达到最大。随着养料的减少，有害代谢产物的积累，生长不可能再无限制地继续。此时比生长速率为养分、代谢产物和时间的函数，其细胞量仍在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐退化，经短时间的减速后进入稳定期，此时净生长速率为零。当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期，此时生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时结束培养。（图例）微生物四个时期的生长曲线其优点是： 对温度的要求低，工艺操作简单； 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题； 对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是： 人力、物力、动力消耗较大； 生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段； 生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的 g 数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。 二、发酵罐结构原理（工作原理）发酵系统由发酵罐、空气处理系统、蒸汽净化系统、电气控制系统、恒温系统及管道、阀门等组成。其工艺流程图如图一。材料与设备一、 发酵菌种：枯草芽孢杆菌-91422 荧光假单胞菌-dgkw 大肠杆菌（含pVAX1）二、 培养基1种子培养基LB固体/液体培养基（略）2发酵培养基枯草芽孢杆菌：糖蜜10g/L，鱼粉10g/L，Nacl2.5g/L，CaCl21g/L，MgSO47H2O1.25g/L，KH2PO4 为0.38g/L，麦麸为5.20 g/L，玉米粉为6.49 g/L。荧光假单胞菌：糖蜜6.73g/L，麦麸13.09g/L，KH2PO4 0.53g/L,米糠10g/L, Nacl 2g/L, MgSO4 1/L。大肠杆菌：糖蜜=4.5g/L 玉米浆=8.5g/L 工业蛋白胨=8.5g/L K2HPO4=2.3g/L KH2PO4=1.5g/L 甘油=10ml/L MgSO4.7H2O=0.25g/L三、 相关试剂（1）3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的配制将1.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于13.33mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶，可以5060溶解），接着加入100mL含26g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入1g结晶酚和1g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至200mL。暗处保存备用（用棕色瓶装）。（2）碘液:5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。 （3）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。 （4）HCl溶液（6N） 用配好的 取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。 （5）NaOH溶液（6N） 用配好的 取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。（6）无氨水：可用一般纯水通过强酸性阳离子交换树脂或加硫酸和高锰酸钾后，重蒸馏得到。（7） 25%的NaOH溶液。（8）10%硫酸锌溶液。（9） 纳氏试剂：称取16g氢氧化钠，溶于50mL水中，充分冷却至室温。 另称取7g碘化钾和碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化钠溶液中。用水稀释至100mL，贮于聚乙烯瓶中，密塞保存。（10）酒石酸钾钠溶液：称取50g酒石酸钾钠(KNaC4H4O64H2O)溶于100mL水中，加热煮沸以除去氨，放冷，定容至100mL。四、 仪器设备双联自动机械搅拌不锈钢发酵罐、空气压缩机、蒸汽发生器、PLC控制柜、电脑、紫外分光光度计、恒温生化培养箱、恒温振荡培养箱、数显恒温水浴箱、超净工作台、电磁炉等。实验步骤一、菌种的制备取冷冻甘油种接种到LB琼脂板中，在琼脂板中挑取单菌落接到试管斜面。取斜面种接种于装有50ml/瓶液体LB培养基的500ml三角瓶中，220rpm,30oC摇床振荡培养过夜（约16h）。根据接种量5%确定种子液为200ml,发酵前准备种子液50ml/瓶共6瓶，2瓶备用。二、发酵液的制备(先有机再无机，最后定容)先取鱼粉40g，麦麸20.8g, 玉米粉25.96g 加热至沸腾并保持微沸30min,然后加入糖蜜40g 过滤培养基然后加入Nacl 10g， CaCl2 4g，MgSO47H2O 5g，KH2PO4 为1.52g。定容至3400ml(10L发酵灌采用发酵液4L,实消时会产生大约15%的冷凝水)。三、工艺流程1. 启动发酵罐打开空气压缩机电源，按start键；检查蒸汽发生器水箱水位，打开电源开关；检查发酵罐水箱水位。2. 发酵罐空消及空气管道消毒待压缩空气压力和蒸汽压力不再上升时，进行过滤器及管道消毒、空消。关V134、V135、开V137、V125，排出夹套中的冷凝水并对夹套进行升温，关V125，关V137。开V126、V152，排尽蒸汽管中冷凝水后将V152转为微开；开V151，微开V106，调节使罐内升压至0.11MPa。关V101，开V121，开V104，排尽冷凝水，将V104调为微开，开V103，关V151，维持罐压0.110.12MPa之间 30min。注意V101一定要关死，防止蒸汽进入流量计使其损坏。关V121，关V103，并迅速打开V101，此时仍然保持V104微开，以便压缩空气将过滤器及管道吹干并维持过滤器为正压。关V103后灌内压力会迅速下降，待罐压降到0.05MPa左右，开V103并调节V103和V106使空气流量保持在6-9之间，罐压保持在0.05MPa。开V135、V134，冷却夹套。注意，冷却过程中一定要随时注意调节V103使罐内压力保持在0.05MPa。防止温度突降造成罐内负压损坏设备。待温度降到50摄氏度时，关V134、V135。3. 发酵罐加培养基实消关V103，开V106，待罐内压力降为零，安装校正好的DO电极和pH电极，从加料口加入培养基。（注意：每一次使用前，PH电极和DO电极均要通电极化，通常PH电极通电极化23h,DO电极通电极化45h）开V137、V125，排出夹套中的冷凝水并对夹套进行升温，将罐内温度加热至80-90摄氏度（整个过程中要搅拌使灌内培养基受热均匀），关V125、V137。开V126、V152，排尽蒸汽管中冷凝水后将V152转为微开；开V151，微开V106，调节使罐内升压至0.11MPa并维持0.11MPa0.12MPa之间，保持30min。关V151、V152、V126、V106。开V135、V134，通冷却水冷却夹套，冷却时为避免灌内产生负生，应间隙开启V103，让压缩空气进入灌内。待温度降至80摄氏度左右，开V103、V106，调节使使空气流量保持在6-9之间进行通气搅拌冷却，罐压保持在0.05MPa，4. 接种培养待温度降到37摄氏度（此温度视不同菌种而定）时按5%的接种量接种。用酒精棉擦洗接种口，并在接种口四周围上酒精棉。调节V103和V106使罐压保持在0以上（注意不能为0，防止污染）。点燃酒精棉，拧开接种口并将螺母置于预先准备的盛有酒精的培养皿中，接种（注意无菌操作），盖上接种口，用湿毛巾灭火并用酒精棉将接种口拭擦干净。调节V103、V106，达到工艺要求的通气量并保持罐压，打开控制柜根据菌种培养要求设置各种参数进行培养。设置初始转速300rpm,温度为30oC,通气量维持在69之间，发酵过程中调节转速保持溶氧在50%以上，当泡沫形成之后流加消泡剂泡敌来消除泡沫，泡敌的流加量不宜过多。5. 取样检测（每隔2h进行取样）开V126，微开V152，保持15min，关V126、V152。开V151、V152放出少量培养液，关V152，用火焰封取样口，用预先灭过菌的取样容器置于火焰上方，对准取样口，并再次开V152至所需取样量。注意无菌操作，在酒精棉的火焰下进行。检测培养液中的还原糖含量、总糖含量，氨氮含量，菌体数量。取样口灭菌，同条。6. 出料培养完毕，打开V151、V152放出培养液。7. 发酵罐的清洗加入自来水，通气搅拌，放净罐内水。如很脏，则关闭电源，旋下电机及各传感器的连线插头。对称拧下罐盖螺母，移走罐盖，加入适量水，用软毛刷刷洗，放净罐内水。再装上罐盖（注意：螺母松紧应基本一不致，不要太紧，否则会引起搅拌轴的倾斜和密封圈的损坏。如杲发酵灌暂时不用，则需排尽灌内及各管道的余水，松开发酵灌灌盖螺丝，防止密封圈变形。结果与分析每隔2 h无菌取样进行以下项目检测：镜检，生物量（菌体数量），活菌数量，还原糖含量，总糖含量，氨氮含量，并记录下相应时刻的PH值，DO值，温度等。1、 生物量的测定浊度法以OD值间接测定生物量：取1 ml样品并用蒸馏水稀释10倍，分光光度计600 nm以蒸馏水做参比测定吸光度。2、 活菌总数的测定平板涂布法测定活菌总数。3、 还原糖含量的测定DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定还原糖含量。在超净工作台取样品0.5mL入试管中，加入0.5mL DNS，沸水浴5min，冷却后加双蒸水4mL，在分光光度计测出A540nm。4、 总糖含量的测定样品预处理：取1mL菌液，加入5mL蒸馏水；再加入4mL 6N HCl，搅匀，震荡。 置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。 加1滴酚酞指示剂，加入4mL 6N NaOH中和至微红色。 将溶液转移至100mL容量瓶（B1）中，定容。 用滤纸过滤。（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。） 测定总糖取样品0.5mL入试管中，加入0.5mL DNS，沸水浴5min，冷却后加双蒸水4mL，在分光光度计测出A540nm。5、 氨氮含量的测定甲醛滴定法测定氨基氮含量。取适量经预处理后的水样0.5mL（使氨氮含量不超过0.1mg），加水稀释至10mL，加1.0mL酒石酸钾钠溶液，混匀，加1.5mL的纳氏试剂，混匀，放置10min后，在波长420nm处，用光程10mm比色皿，以蒸馏水为参比，测量520nm吸光度。6、 PH值，DO值，T值等直接由PLC软件读取报告撰写根据发酵数据绘出相关曲线图并分析（生物量曲线图，活菌数量曲线图，PH值曲线图，DO值曲线图，还原糖消耗曲线图，总糖消耗曲线图，氨氮变化曲线图）。附：发酵灌使用前准备工作及注意事项:1、 空气源的检查：主要检查空气压力及湿度是否正常。供气压力应在0.207MPa之间，相对湿度应小于60%。2、 管道、阀门的检查：检查管道及阀门是否有泄漏。3、 电气仪表的检查：发酵灌温度显示是否正确;校检压力表，空气减压阀等。4、 温度、PH值、DO值的校正。5、 温度、PH值、转速等参数的设定与调节。6、 在过滤器消毒时，流经精过滤器的蒸汽压力不得超过0.17MPa,否则会滤器滤芯会被损坏，失去过滤能力。7、 在操作过程中，灌压不得超过012MPa,防止引起设备损坏。8、 在空、实消结束后冷却时，发酵灌内严禁产生负压，以免损坏设备或造成污染。9、 在发酵过程中，灌压应维持在0.030.05MPa之间，通常维持在0.05MPa,以免引起污染。10、 在各操作过程中，必须保持空气管道中的压力大于发酵灌的灌压，否则会引起发酵灌中的液体倒流到过滤器中，堵塞过滤器滤芯