君子兰组织培养的研究.doc

课题名称： 君子兰组织培养的研究 论文开题报告学生姓名学号导师姓名课题名称君子兰组织培养的研究1选题依据（课题研究的目的、意义，国内外研究现状分析3000字左右，附主要参考文献）1.1 研究目的：君子兰(Clivia miniata Regel)为石蒜料属多年生常绿草本，其植株文雅，株型俊秀，有君子风姿，花如兰，而得名。宜盆栽室内摆设，为观叶赏花，也是布置会场、装饰宾馆环境的理想盆花。它一般采用分株法进行繁殖,因母株萌芽少, 特别是优良品种产生小芽更少, 因此君子兰繁殖速度慢, 繁殖量少。用种子繁殖, 实生苗不但容易产生变异, 而且小苗生且长慢。为了加快君子兰的繁殖, 国内外已将茎、叶、花瓣、花丝、根等器官作外植体进行了离体繁殖研究，取得了一定的进展。在种子组织培养过程中, 发现种子在培养基上不仅能像在播种基质中一样萌发, 而且能通过诱导产生愈伤组织分化成苗, 能大大提高繁殖系数。1.2 研究意义：(1)君子兰的有性繁殖后代为高度杂合型, 亲本的优良性状不能通过杂交得到稳定保存。目前, 君子兰的繁殖多采用分株、种子繁殖方式, 获得的新植株可以保持其母本原有的性状, 不会发生变异。而分株繁殖每年每株仅可分得1- 3株, 增殖倍率不高, 极大地限制了君子兰的生产和开发。近年来, 采用君子兰种胚进行快速繁殖, 以提高其繁殖系数。目前, 随着花卉业的迅猛发展, 君子兰新的优良杂交品种不断涌现。为了提高君子兰的繁殖速度, 许多学者开始探索通过组织培养快速繁殖君子兰的新途径。(2) 君子兰花期长达3个月, 有很高的观赏价值, 经济价值也很高。君子兰的离体繁殖, 为君子兰工厂化生产提供了可行的途径。君子兰组织培养的条件可以严格控制, 不受时间、季节限制, 因此, 已成为君子兰种苗繁殖的重要手段, 并已在商业化生产中显示出其优越性。(3)正常君子兰植株, 繁殖方法有分株繁殖和种子繁殖，要经过35年培育, 才能开花结实; 有性繁殖系数一般一次产生100粒左右的种子, 有性繁殖中, 同一品种授粉率低, 同株授粉结实率更低, 并且后代生活力减退。因此君子兰繁殖一般采用不同品种授粉, 后代变异, 难以保持优良品种的种性。分株繁殖一般在34 月间进行, 将母株周围产生的小苗切离, 另行种植。靠分株繁殖, 平均每年分不出1 株。也可采用播种繁殖。大花君子兰需人工授粉方可结实,约89个月后果实成熟, 一个果实具种子140 粒,总的增殖倍率不高, 难以满足由于人们精神文化需求的日益增长对花卉的大量需求。我们拟通过组织培养技术, 大量快速繁殖, 在短期内获得纯度高、数量大、和母本一致的名贵品种后代, 这样不仅可满足国内人们生活的需要, 而且可以以试管苗出口。(4)君子兰采用组织培养繁殖,可在短期内获得大量可用于栽培的君子兰幼苗, 年增殖率达数百万倍, 尤其对于珍稀、优、新品种的培育和繁殖是非常有价值的方法。采用茎尖培养还可去除病毒, 解决因长期无性繁殖导致病毒积累而引起的观赏植物品质下降问题。利用组织培养技术还可以有效地保存植物种质资源。1.3国内外现状分析：(1)自从20世纪80年代以来, 君子兰的组织培养、快速繁殖和脱毒方面有不少的研究报道。从材料选择到试管苗移栽君子兰的组织培养过程大体可分为培养材料的选择、培养前的消毒处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织继代和增殖培养、芽的分化培养、展叶培养、根的分化培养和试管苗移栽等阶段。我国20世纪40年代有胜利、和尚、染厂和油匠等栽培品种。到80年代有花脸和尚、圆头、春城短叶、黄技师等栽培品种。又有膜膜君子兰、芳叶和金丝兰等新品种问世。君子兰的栽培品种根据其株型大小、叶片长短、长宽比例、叶尖形状、叶脉隐显和花色、果型等区分。总的来说，叶片以短而宽、厚而硬、叶面鲜艳而有光泽、挺拔而整齐、叶端浑圆、脉纹凸起为良种，花朵大而呈黄色为精品。在日本，君子兰的观叶种比观花种更受重视，而美国、欧洲着重于花色的改良。(2)实验证明了不同的外植体需要不同的营养和不同的植物激素用量, 这一点自上个世纪60 年代法国兰花工业( o rchid indust ry ) 的兴起, 开始了花卉的组织培养繁殖。这一方法的推广, 大大促进了优良花卉品种的选育与繁殖, 开创了花卉事业发展的新局面。君子兰的许多部分都可作为外植体，且易于经愈伤组织不定芽分化途径再生。如成熟胚、未开放花蕾的子房、花托、花丝、花被筒、花柱、子房、子房壁、胚珠、胎座、幼胚、幼叶、茎夹、叶片甚至根尖曲折等等。但是，再生出小植株的机率与所需时间差异很大，以成熟胚的下胚轴及茎尖、幼叶等材料培养效率较高。(3)植物生长调节剂是培养基的重要组成部分。同一种君子兰的不同器官、同一培养物的不同生长发育阶段都需要使用1种或几种不同剂量的植物生长调节剂, 对培养物的生长和分化加以控制。在君子兰试管苗培养过程中, 细胞的增殖、芽的分化和生根也是由添加的植物生长调节物质控制的, 这是君子兰组织培养成败与否的关键。(4)君子兰的组培和其他植物组培一样, 要求在严格的无菌条件下进行, 除了对培养基进行高温、高压灭菌外, 对于首次培养的材料, 也必须进行严格的表面消毒灭菌。整个操作过程都在超净工作台上完成。培养材料的灭菌方法较多, 应根据所选择的君子兰材料而定。在君子兰组织培养中, 主要以成熟胚、幼胚、子房、花托和花丝作为培养材料。一般情况下, 君子兰幼年的组织较老年的组织有较高的形态发生能力。 (5)常规君子兰花期长达3个月, 有很高的观赏价值, 经济价值也很高。目前，君子兰生产上主要是播种和分株繁殖。种子繁殖无法保持母体的优良性状，而分株繁殖的系数很低，无法满足商品生产的需求。君子兰的离体繁殖, 为君子兰工厂化生产提供了可行的途径。君子兰组织培养的条件可以严格控制, 不受时间、季节限制, 国内外很多学者对君子兰的组织培养进行了不断的尝试，取得了一些成果，但进展缓慢。因此,组织培养快速繁殖已成为君子兰种苗繁殖的重要手段, 并已在商业化生产中显示出其优越性。参考文献 1 陈宣耀. 长春君子兰精品赏析与培育M . 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 2004: 10- 12. 2 孙可群, 张应鳞, 龙雅宜, 等. 花卉及观赏树木栽培手册M . 北京: 中国林业出版社, 1998: 75- 80. 3 FINNIE J F, VAN S J. 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Clivia Yearbook,1998(1):7-11.19 叶露莹. 君子兰组织培养与快繁技术研究进展J. 亚热带农业研究,2006,2(3):231-233.20 林淦,韩萍,王海燕.君子兰快速离体繁殖研究J.安徽农业科学,2007,35(15):4439,4445.2 研究方案2-1研究目标、研究内容和拟解决的关键问题：2.1.1研究目标实验探讨我国君子兰的组织培养方面的研究进展，包括外植体选用，不同基本培养基和激素对君子兰增殖与分化的影响与褐化的防治，并对君子兰组织培养问题进行讨论。筛选适宜君子兰叶片离体的条件。选取君子兰品种“油匠”的叶片为外植体进行离体培养，在MS 培养基中附加不同浓度的2,4-D、BA、NAA 和KT，对外植体采用不用时间的低温预处理，并对接种后的外植体分别进行不同时长的暗培养，研究不同培养条件对外植体愈伤组织诱导和分化的影响。2.1.2研究内容在MS 培养基中附加不同浓度的2,4-D、BA、NAA 和KT ，蔗糖浓度3%，琼脂用量3 g/L，pH5.8。用于筛选叶片外植体愈伤组织诱导与分化的最佳培养基；将培养基MS + BA2.0 mg/L + NAA3.0mg/L + KT1.0 mg/L 中的活性炭浓度分别设为0、1、3、5g/L，接种叶片外植体，研究活性炭对愈伤组织的诱导与分化的影响；对外植体采用0、5、10、15 d 的4低温预处理，培养基同上，研究低温预处理对外植体愈伤组织诱导和分化的作用；对接种后的外植体分别进行10、20、30 d 的黑暗培养，培养基同上，以正常每天12 h 暗培养为对照，研究暗培养对外植体愈伤组织诱导和分化的影响。.培养室温度24 ，光照强度2 000 lx，每天光照12 h。以上每个处理接种8 瓶，每瓶10 12个外植体。定期记录观察外植体生长、诱导和分化情况。10 周时调查愈伤组织诱导情况，30 周时统计分化成苗数。诱导率（%）=（诱导愈伤组织外植体数/接种外植体数）100分化率（%）=（分化成苗外植体数/诱导愈伤组织外植体数）100原球茎继代中褐化的防治：在继代培养基添加0.5- 1.0g/L 活性炭（AC）可抑制培养物产生红色的多酚氧化物，降低褐化率，从而提高增殖速度。缩短继代周期，如在外植体接种7 天时进行继代，也可降低诱导过程的褐化现象。采用降低琼脂用量制成半固体培养基，将培养块浸在培养基内，也可降低培养块黄枯和切口褐化的机会(1)愈伤组织培养阶段对生长调节剂的要求不同材料的愈伤组织培养阶段对生长调节剂的要求有所不同。采用未成熟胚(授粉15 d后)作为培养材料, 在MS培养基上附加一定质量浓度的生长素和细胞分裂素有利于愈伤组织的诱导, 植物生长调节剂一般可用NAA ( 0. 01- 4.0mg L- 1 )、6BA ( 0. 2- 0. 5 mg L- 1 ) 和ZT ( 0. 1- 1. 0 mg L- 1 )等; 采用胚、花萼、叶 8 、花丝、根、花柱、子房壁为培养材料, 以MS为基本培养基, 采用一定质量浓度的2, 4D、6BA 和NAA 有利于愈伤组织的诱导; 采用花托、子房为培养材料, 在MS培养基上附加一定质量浓度的KT( 0. 5- 3. 0mg L- 1)和NAA( 0. 5- 2. 0mg L- 1)则有利于愈伤组织的诱导。(2)芽的分化阶段对生长调节剂的要求以未成熟胚(授粉15 d后)为培养材料, 在M ille或MS 培养基上附加KT( 0. 5- 2. 0mg L- 1 )和NAA( 0. 25- 2. 0 mg L- 1 )有利于芽的诱导; 以胚、花萼、叶、花丝、根、花柱、子房壁为培养材料, 在MS培养基里添加一定质量浓度的2, 4D( 0. 5- 2. 0mg L- 1 )、6BA1. 0 mg L- 1和NAA ( 0- 5. 0 mg L- 1 ) 可促进芽的分化。也有研究表明, 以叶片为培养材料, 可采用一定质量浓度的6BA、NAA和LH进行芽的诱导; 以花托、子房为培养材料, 可采用1 /2MS无机盐、MS有机物和一定质量浓度的ZT 、NAA和IAA进行芽的诱导。(3)生根培养阶段对生长调节剂的要求以未成熟胚(授粉15 d后)为培养材料, 在M iller或MS培养基上附加一定质量浓度的KT和NAA 有利于长根, 但所使用的激素质量浓度不宜过高; 采用胚、花萼、叶、花丝、根、花柱、子房壁为培养材料, 在MS培养基上附加一定质量浓度的2, 4D、6BA 和NAA 有利于长根; 以花托、子房为培养材料, 采用1 /2MS无机盐+ MS有机物+ 一定质量浓度的IBA、6BA、IAA, 有利于根的诱导。2.1.2拟解决的关键问题为了促进君子兰的大量繁殖和出口，我们需先找出适合快繁的外植体和相应的培养基;外植体扩繁殖途径；如何促进芽体成苗和不断增殖；壮苗成株, 促进生根和移栽等技术。在组织培养快速繁殖过程中, 茎尖是最常采用的外植体, 但是君子兰的茎为短缩茎, 不仅取材难度很大, 难以彻底将其消毒, 并且接种后褐化严重, 此外, 君子兰1 株植株只有1个茎尖, 对植株的取材直接导致其死亡。虽然有人采用君子兰的花瓣、花丝、子房等为外植体获得过再生苗, 但愈伤组织诱导率和分化率均较低。(1)分析在君子兰组织培养过程中可能出现的几种关键问题在组织培养快速繁殖过程中, 茎尖是最常采用的外植体, 但是君子兰的茎为短缩茎, 不仅取材难度很大, 难以彻底将其消毒, 并且接种后褐化严重, 此外, 君子兰1 株植株只有1个茎尖, 对植株的取材直接导致其死亡。(2)在培养过程中培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯。对培养的进行有阻碍。愈伤组织生长过旺，疏松，后期水浸状。(3) 与一般植物组织培养相比，君子兰培养物生长、分化缓慢，这必将成为君子兰组织培养在商业化生产上应用的制约因素。(4)侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织，可能原因是采样技条过嫩，生长素、细胞分裂素用量过多。(5)某些情况下在前期组织培养中虽然有少量愈伤组织形成, 但在后期培养未见继续分化、生长, 而在培养过程中出现严重褐变。(6)君子兰的组织培养中, 由于获得茎尖对母体伤害极大,不宜做外植体，而以种子为外植体会出现广泛的变异、优良性状消失。2-2针对研究内容拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析2.2研究方法(1)材料的消毒先用自来水冲洗外植体数分钟, 并用肥皂水洗耐表面, 再用白来水冲洗干净, 然后在无菌条件下用75 % 乙醇浸泡30 秒, 放进5 % 次氯化钠消毒10 分钟, 或用饱和漂白粉上清液消毒30 分钟(另根据外植体的部位而变动消毒时间) , 最后用元菌水冲洗5 次。根据不同外植体切割或不切割, 接种于不同培养基中(2)试验了MS 、B5 、ER 、SH、White五种基本培养基; 并在M s 培养基的基础上添加不同激素、生长素, 共设计了5种培养基。接种材料放置于2428, 10 小时光照的培养室内培养。(3)不定芽产生后, 分二种方法进行培养: 一是转入固体分化培养基, 一是转入液体培养基。(4)试管苗的生长发育需要一定的光照和温度。组培室的温度应在2025, 每日给光照812h, 光照强度为1 5002 500lx , 生根阶段可适当提高光照强度,以利于小苗生根, 提高幼苗移栽成活率。若采用自然光照, 则较灯光照明的幼苗素质好, 能更好适应移栽后的新环境。2.3技术路线 2.4实验方案 2.4.1外植体的选择在君子兰织培养中, 主要以成熟胚、幼胚、子房、花托和花丝作为培养材料。一般情况下, 君子兰幼年的组织较老年的组织有较高的形态发生能力。(1) 以成熟胚或花蕾为外植体，做表面灭菌后，按无菌操作取出子房或胚，放置到MS 固体培养基上，种胚用MS+2，4- D5 mg/L+ 水解乳蛋白100mg/L，子房、花托等培养时可加KT2-3mg/L+NAA0.5mg/L 或者NAA2mg/L+KT0.5mg/L。在各外植体诱导愈伤组织阶段的最适培养基为MS+2，4- D1 mg/L+BA0.6 mg/L 即可(2) 外植体在激素诱导下逐渐产生愈伤组织，种胚接种后20 天可萌动生长，以后胚轴膨胀变粗，渐形成淡黄色愈伤组织。及时将愈伤组织转移到MS+BA2+NAA0- 0.1 的分化培养基上，经6- 8 周后，一部分愈伤组织转为淡绿色，逐渐可用放大镜观察到小幼叶，以后可见许多小幼芽不断生长出来。每块1cm2 以上的愈伤组织可出芽几个到十几个。将这样的材料接转到新鲜培养基上用作继代增殖，以便得到更多的愈伤组织和小幼苗。较大的幼苗转到1/2MS+KT0.5+NAA0.1 或1/2MS+IBA0.2+BA0.1 的或与此相接近的激素成分的培养基上，使其长壮并生根，其中的细胞分裂素用于保持细胞分裂的活性和使材料保鲜，生长素用于诱导生根。在生根壮苗培养基中亦可加些活性炭0.5%，促进生根。(3) 子房和花托等在培养4 周后，有少许愈伤组织长出，以后需转移到MS+KT2- 3+NAA0.5 的培养基上，可以加快愈伤组织生长。10 周后可获得较大的呈瘤状黄色的愈伤组织块，将它转到1/2MS+ZT1+NAA0.2+IAA0.1+蔗糖1.5%的分化培养基上，每4- 6 周转一次，约需转接2 次，便可见分化出芽，每团愈伤组织可出10 多个芽，用相同培养基使之继代增殖，获更多芽苗。待小芽变绿长大时，转到1/2MS+IAA0.6+IBA0.2+BA0.05+ 蔗糖1.5%的壮苗生根培养基上，不久小苗长大，抽出新叶，并生出良好的根。(4)君子兰的种子苗根尖可以用MS+BA1+NAA0.1+ 蔗糖4的培养基，先诱导其产生愈伤组织，随后转到MS+BA3+NAA1.5+2，4- D1mg/L+蔗糖1.5的诱导产生幼芽的培养基上培养，以后再将大于2cm的小苗移到1/2MS+IAA0.5（或NAA0.5）+ 蔗糖1.5%或2的培养基上诱导生根，便能获得完整植株。(5)用叶片培养产生再生植株的培养基为：MS+BA1+NAA2+2,4- D1+ZT1+LH10+ 蔗糖4产生出愈伤组织后，转到下述分化培养基上：MS+BA2+NAA0.05+LH100- 500mg/L+ 蔗糖4，约经2 个月后，即可形成小芽丛。(6)如采用茎尖和幼叶培养，有较其它部分更高的绿苗诱导率，愈伤组织诱导用MS+2，4- D1+BA0.