生物大分子相互作用分析.pdf

原理 应用和方法原理 应用和方法原理 应用和方法原理 应用和方法 生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析生物大分子相互作用分析 广西亚热带 生物资源保护利用重点实验室 技术支撑组技术支撑组技术支撑组技术支撑组 付强付强付强付强 Mail gxfuq Tel 0771 3235266 主要内容主要内容主要内容主要内容 一 生物大分子相互作用的研究 二 BIAcore简介和工作原理 三 BIAcore的应用领域 四 BIAcore的一般分析流程 五 应用实例 一 生物大分子相互作用的研究 二 BIAcore简介和工作原理 三 BIAcore的应用领域 四 BIAcore的一般分析流程 五 应用实例 1 生物大分子种类 蛋白质 核酸 多肽及糖类物质等 2 研究重点 A 配体与受体的相互作用 蛋白质相互作用动力学 蛋白质调控通路 B 酶与配体的相互作用 复制 转录过程 酶 DNA 酶 蛋白质互作关系 C RNA与蛋白质相互作用 RNA干涉 小RNA与蛋白因子协同作用 D 蛋白质与糖类相互作用 糖蛋白需短寡糖链的装配 例如 激素 抗体 酶等 寡糖链往往是受体 酶类的识别位点 一 生物分子相互作用的研究一 生物分子相互作用的研究一 生物分子相互作用的研究一 生物分子相互作用的研究 一 生物分子相互作用的研究一 生物分子相互作用的研究一 生物分子相互作用的研究一 生物分子相互作用的研究 3 大分子互作研究方法 A 酵母双杂交系统 THS B 化学发光共振能量转移 BRET C 双分子荧光互补 BIFC D 生物分子相互作用分析 BIA E 蛋白芯片 PC 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 1 BIA定义 BIA Biomolecular Interaction Analysis 生物分子相互作用分析 2 BIAcore的历史 1990年 首台SPR仪 BIAcore X 1995年 BIAcore C系列 1999年 BIAcore 3000 2003年 高通量的BIAcore T A X BIAcore X BIAcore 3000 BIAcore C BIAcore AB BIAcore Flexchip BIAcore X100BIAcore T100BIAcore A100 3 BIAcore系列分子互作分析仪 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 4 其他品牌的分子互作分析仪 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 光路和检测系统 IFC系统 自动进样器 芯片及卡盘 进样泵 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 5 BIAcore3000组件 6 BIAcore3000液体流通系统 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 Pump 1 缓冲液不断流通 2 控制进样针 容积500微升 Connector block 液体流路系统进样口 Autosampler 自动进样器 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 7 BIAcore的三个核心技术 A 表面等离子共振 Surface Plasma Resonance SPR B 微射流卡盘 Integrated Fluidic Cartridge IFC C 芯片 Chips 反射镜 透镜 光栅 透镜 偏振片 棱镜 透镜 检测器 injection 近红外光 光路和检测系统示意图 8 表面等离子共振 SPR 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 入射光 8 表面等离子共振 SPR 棱镜 检测器 反射光 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 A 基于物理光学现象 金属表面存在自由电子按一定的 方向水平移动 当受到光照射后 光 能使金属表面电子发生共振 入射光 强度减弱 导致反射角度出现偏差 B 反射角变化与金属的质量成正比 将配体固定在芯片上 分析物流过 芯片表面上 结合量的变化导致SPR信 号的产生 C RU值 Response Unit 的概念 共振单位 1RU 1pg Flow cell 9 微射流卡盘 IFC 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 B IFC上密布液体通路和气阀 IFC 液体传送系统 由计算机控制气阀的开闭从而控制液体的流路 9 微射流卡盘 IFC 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 B 大部分为管状封闭结构 部分为凹槽结构 管道内径10uM 9 微射流卡盘 IFC 二 二 二 二 BIAcoreBIAcore简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理简介和工作原理 F1F1 F2F2 F3F3 F4F4 F1 4M MgCl2 高pH 50mM NaOH 0 5 SDS 从温和条件到严苛条件 最大再生100次左右 One sensor chip can be used for repeated measurement 50 100 run 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 5 芯片再生 Regeneration C 再生结果判断 根据表面测试后基线稳定性判断 理想的再生 结合RU值稳定 基线持平 不完全再生 结合RU值降低 基线增加 过度的再生 结合RU值降低 基线降低 6 BIAevaluation软件分析 A 特异性 Specificity 结合有无 B 动力学常数计算 Kinetics 结合速度 C 亲和性常数计算 Affinity 结合强度 D 浓度分析 Concentration 结合的量 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 concentration Kinetics How Fast How Fast affinity How Strong How Strong How Much How Much Specificity Yes or No Yes or No 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 6 BIAevaluation软件分析 A 特异性 Specificity 结合有无 kakd Kinetics What are the rates of association and dissociation 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 6 BIAevaluation软件分析 B 动力学常数计算 Kinetics 结合速度 C 亲和性常数计算 Affinity 结合强度 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 6 BIAevaluation软件分析 D 浓度分析 Concentration 结合的量 类似于Bradford法定量蛋白质 LowLowHighHigh ConcentrationConcentration AffinityAffinity KineticsKinetics SpecificitySpecificity 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 6 BIAevaluation软件分析 E 用于不同分析目的的耦联量要求分析 特异性分析 耦联量适中 浓 度 分 析 耦联量较大 亲和性分析 耦联量较低 动力学分析 耦联量极低 四 四 四 四 BIAcoreBIAcore的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程的一般分析流程 7 BIAcore样品回收 A 从 IFC 回收 可实时监测回收量 回收量较小