多重PCR检测临床产ESBLs大肠埃希菌的耐药基因型研究.doc

多重PCR检测临床产ESBLs大肠埃希菌的耐药基因型研究作者：姚杰,陶勇,贾建安,吕晴单位：合肥 解放军第105医院检验科(姚杰，贾建安，陶勇);合肥 安徽医科大学第二附属医院检验科(姚杰)【摘要】目的 了解产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药性、产ESBLs的阳性率及耐药基因之间的关系。方法 采用Kirby-Bauer(K-B)琼脂扩散法检测120株临床分离的大肠埃希菌对18种抗生素的耐药性, 用酶抑制剂增强实验纸片法检测产ESBLs菌株,运用多重PCR技术检测相关耐药基因,用DNA序列分析确认基因亚型。结果 120株大肠埃希菌产ESBLs的有51株,阳性率为42.5%。120株大肠埃希菌对亚胺培南全部敏感，产ESBLs的大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶等头孢类抗菌药物的耐药率高达100%;51株产ESBLs菌株其中46株扩增到CTX-M型耐药基因, 44株扩增到TEM型基因,2株扩增到SHV基因，1株OXA型基因，未检出PER和VEB型。结论 大肠埃希菌产ESBLs较高,耐药显著，碳青酶烯类抗生素是目前治疗产ESBLs大肠埃希菌最有效的药物;产ESBLs大肠埃希菌的主要基因型别为CTX-M型和TEM型。 【关键词】 超广谱β-内酰胺酶;大肠埃希菌;多重PCR;耐药性;基因型Multiplex PCR assay for genotype of ESBLs-producing Escherichia coli in clinical isolatesYao Jie，Tao Yong，Jia Jianan，et alDepartment of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601Abstract Objective To investigate the production of extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) of the drug resistance of Escherichia coli producing ESBLs positive rate and the relationship with the resistance gene.Methods The K-B agar diffusion assay the resistance of 120 clinical isolates of Escherichia coli to the 18 kinds of antibiotics, using enzyme inhibitors enhance paper to test phenotype of ESBLs, using multiplex PCR to detect related resistance gene, and using DNA sequence analysis to confirmed the gene subtypes.Results 51 of 120 Escherichia coli producing ESBLs, the positive rate was 42.5%. All of 120 isolates are sensitive to imipenem, the antimicrobial resistance rate of ESBLs-producing isolats to cefazolin, cefotaxime, ceftriaxone, cefoperazone,ceftazidime and other cephalosporins was as high as 100%; 51 strains producing ESBLs which amplified 46 to CTX-M-type resistance gene, amplified by 44 to TEM-type genes, two amplified SHV genes and one OXA-type genes. PER-type and VEB-type were negative.Conclusion Carbapenem antibiotics is currently the most effective drugs to treatment Escherichia coli which producing ESBLs; the major genotypes were CTX-M-type and TEM-type.Key words ESBLs;Escherichia coli;Multiplex PCR;Resistance;Genotype大肠埃希菌是临床感染的主要病原体之一,由质粒介导的产ESBLs大肠埃希菌又是最常见的耐药菌。随着广谱抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素的大量使用,产ESBLs的肠杆菌科细菌耐药性日益严重,而产ESBLs大肠埃希菌是目前医院感染的主要病原菌。近年来,产ESBLs的大肠埃希菌的检出率不断增加,而且不同国家、地区ESBLs的流行株各有差异,其携带的耐药基因型各不相同,水解β-内酰胺类药物种类和能力也不一样1。据报道2005年国内产ESBLs大肠埃希菌平均占38.9%2。本研究旨在了解产ESBLs大肠埃希菌的药物敏感性,并通过常见基因型别的检测鉴定其产ESBLs的情况,同时在此基础上探讨耐药性与基因型的关系,为进一步认识ESBLs和临床合理用药提供理论依据。 1 材料与方法1.1 菌株来源 收集解放军第105医院自2008年4月至2008年10月分离的120株大肠埃希菌，排除了同一患者同一部位重复菌株。1.2 培养基和试剂 培养基和药敏纸片M-H琼脂及药敏纸片购自英国OXIOD公司。质粒基因抽提纯化及聚合酶链反应(PCR)试剂盒为广州达安生物科技有限责任公司产品,按试剂盒说明书操作。1.3 质控菌株 大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603，标准产TEM、SHV及CTX-M酶大肠埃希菌，均由安徽省细菌耐药性监控中心提供。1.4 ESBLs测定 严格按照NCCLS规定的试验方法操作，在M-H琼脂上分别贴上含及不含克拉维酸的头孢他啶及头孢噻肟纸片对比。任何一种含克拉维酸的药敏纸片比不含克拉维酸的相应纸片抑菌环直径≥5 mm为ESBLs表型阳性,大肠埃希菌ATCC 25922在每对两纸片间直径差≤2 mm,肺炎克雷伯菌ATCC 700603在头孢他啶一对纸片中的抑菌直径差≥5 mm,在头孢噻肟一对纸片中相差≥3 mm为本方法的质控标准,本研究中的质控测定均在以上合格范围之内。1.5 药敏试验 采用K-B琼脂扩散法检测120株临床分离的产ESBLs阴沟肠杆菌对18种抗生素的耐药性，严格按NCCLS操作规程操作。1.6 主要仪器设备 法国梅里埃ATB 152微生物分析系统;ABI 9700型基因扩增仪;ABI 3130基因序列分析仪。1.7 PCR扩增 根据基因同源性的不同,目前将ESBLs分为5类,即TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型别如Toho、PER、VEB等基因型。参照文献37设计合成TEM、SHV、CTX-M、OXA、PER和VEB等6组通用引物，其中CTX-M 引物的靶基因分为4组(Ι组包括CTX-M-1、3、10、11、12、15、22、23、28、29、30;组包括CTX-M-2、4、5、6、7、20、Toho-1;组包括CTX-M-8、25、26;组包括CTX-M-9、13、14、16、17、18、19、21、27、Toho-2)，见表1。PCR反应体系共25 μl，反应条件为95预变性15 min,94变性30 s,62退火90 s,72伸延60 s,30个循环,最后72伸延10 min。PCR产物在含0.5 μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯下观察结果,在凝胶成像系统上成像。表1 ESBLs各基因型PCR特异引物1.8 PCR产物测序 将扩增产物进行测序,结果与GenBank颁布的序列进行比较分析。1.9 统计学方法 K-B纸片扩散法药物敏感试验结果采用WHO推荐的细菌耐药性监测软件Whonet 5.4进行统计分析。2 结果2.1 产ESBLs菌株的检出率 120株大肠埃希菌中产ESBLs的有51株，阳性率为42.5%。2.2 大肠埃希菌的耐药情况 药敏结果显示，120株大肠埃希菌对亚胺培南全部敏感。产ESBLs的大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶等头孢类抗菌药物的耐药率高达100%，但是对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率较低，为44.6%;对阿米卡星的耐药率为52.3%。产ESBLs的菌株对除碳青酶烯类之外的抗菌药物耐药率明显高于非产酶株，见表2。表2 120株大肠埃希菌药敏试验结果2.3 PCR扩增结果及产物分析 51株产ESBLs大肠埃希菌中TEM型耐药基因阳性的有44株(占86.3%),SHV型阳性的有2株(占3.9%),CTX-M型阳性的有46株(占90.2%),OXA型阳性的有1株(占1.96%),未检出PER和VEB型，见附图。2.4 ESBLs基因型分析 51株产ESBLs的大肠埃希菌中同时携带两种或两种以上基因型有41株，占80.4%，见表3。表3 51株大肠埃希菌产ESBLs的基因型分布2.5 基因测序结果 对所检测出的46株含CTX-M型耐药基因的阳性菌株进行测序, 结果与GenBank所颁布的序列进行比较与分析，其中CTX-M-3型13株(占28.3%),CTX-M-8型4株(占8.7%),CTX-M-14型29株(占63.0%),其中有1株共同带有CTX-M-3型和CTX-M-8型基因,1株共同带有CTX-M-8型和CTX-M-14型基因,2株共同带有CTX-M-3型、CTX-M-8型和CTX-M-14型基因,其余42株CTX-M型菌株均带有单个CTX-M基因;在检出的44株TEM型均为TEM-1亚型;2株SHV型均为SHV-1亚型。3 讨论ESBLs是由质粒介导的能使细菌对三代头孢菌素类、单酰胺类及青霉素类耐药的一类酶,可在菌株间转移或传播8,9。在分类上属于Bush 2be型,Ambler A 类酶,其水解的底物包括青霉素类、第一至三代头孢菌素(部分酶可水解第四代头孢菌素)、单环β-内酰胺类抗菌药物,但不能水解β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合药物、头霉素类及碳青酶烯类抗菌药物10。由于产ESBLs的菌株对临床常用的抗菌药物广泛耐药，它们的扩散导致了感染患者治疗起来越来越困难的全球性健康问题11。TEM-1型耐药基因于1965年从希腊雅典的一位名叫Temoneira的患者分离出的大肠埃希菌中检测出而首次报道12。此基因是在临床分离菌株中所发现分布广泛的质粒介导β-内酰胺酶基因。TEM-1型β-内酰胺酶决定青霉素和一些早期头孢菌素的耐药性，对超广谱头孢菌素类抗菌药物几乎无抵抗作用且可被克拉维酸抑制。本研究中51株产ESBLs大肠埃希菌检出44株TEM-1广谱酶基因,说明其存在的普遍性。非ESBLs大肠埃希菌69株对氨苄西林和哌拉西林耐药率均为82.4 %，推测TEM-1型广谱酶在非ESBLs大肠埃希菌也普遍存在。国外以往的研究显示, ESBLs的基因型以TEM型和SHV型为主,对三代头孢菌素耐药,其中对头孢他啶高度耐药,而对头孢噻肟低度耐药。上世纪90年代后期，随着三代头孢菌素尤其是头孢噻肟和头孢曲松在临床上的大量使用, 一种新的CTX-M型ESBLs的数量在不断增加,尤其在大肠埃希菌中13。资料显示,CTX-M型是中国产ESBLs菌株的主要基因型,其特征是该基因型产生的ESBLs对头孢噻肟和头孢曲松的水解能力很强,而对头孢他啶的水解能力相对较弱14。由于我国使用第三代头孢菌素主要为头孢噻肟而国外为头孢他啶,也导致我国ESBLs基因分布主要为CTX-M的结果15。CTX-M型酶对头孢噻肟、头孢他啶的水解能力比对青霉素强,相对于头孢他啶来说,更优先水解头孢噻肟。除了能迅速水解头孢噻肟之外, CTX-M型酶还有一独特特征,即三唑巴坦比舒巴坦和克拉维酸能更好地抑制其活性16。本研究中,产ESBLs大肠埃希菌大部分为CTX-M型基因编码所致(90.2%),而且有多株同时携带两种或两种以上基因型(80.4%),很可能与临床上长期大量使用头孢噻肟、头孢曲松等三代头孢菌素,诱导细菌质粒耐药基因突变或选择性细菌耐药株产生和传播有关。药敏结果显示,产ESBLs 菌株对大多数β-内酰胺类药物明显耐药,并显示出多重耐药性。对含β-内酰胺酶抑制剂复合制剂如头孢哌酮/舒巴坦较敏感,而对阿莫西林/克拉维酸明显耐药，这可能与舒巴坦抑菌作用优于克拉维酸有关,亦可能与本院较少使用该药有关;对氨基糖苷类、氟喹诺酮类多数耐药(阿米卡星除外);对复合磺胺亦高度耐药。产酶株和非产酶株对亚胺培南全部敏感,提示临床治疗产ESBLs菌株引起的感染首选药物应为碳青酶烯类抗菌药物。由于ESBLs在过去的20年里不断的演化和发展，再加上质粒介导的对喹诺酮类及碳青酶烯类抗菌药物潜在的耐药性，必将会对将来的感染治疗带来显著的问题17，18。在未来的五到十年不大可能会有太多新的抗菌药物可用来治疗这样的多重耐药感染。因此，加强感染控制以及对抗菌药物的严格管理将在限制ESBLs的传播扩散上起着非常重要的作用。同时,细菌通过多产酶基因的并存从而达到增强耐药性及加宽耐药谱的目的,以抵御多种抗菌药物攻击,增加了抗感染治疗难度。因此,应加强对产ESBLs菌株分子流行病学监测,为指导临床合理用药提供依据,延缓耐药菌产生并防止耐药菌播散。【参考文献】 1 季淑娟,顾怡明,谭文涛,等.中国部分地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型研究.中华检验医学杂志,2004,27(9):590-593.2 汪复.2005中国CHINET细菌耐药性监测结果.中国感染与化疗杂志,2006,6(5):289-295.3 Fang H, Lundberg C, Olsson-Liljequist B, et al. 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