测定项目及方法.doc

实验测定项目及方法好果率: 好果率（%）=（好果数/果子统计总数）100% 以未发生病害，冷害，机械性损伤和霉变的果实为好果，通过技术和数学的方法进行统计。果实硬度： 应用果实硬度计（GY-1 型果实硬度计）。 果实硬度计设计原理果实硬度是指水果单位面积（S）承受测力弹簧的压力（N），它们的比值定义为果实硬度（P）。P =N/SP被测水果硬度值105帕或（公斤每平方里米）N测力弹簧压在果实面上的力 N牛顿或(公斤)S果实的受力面积 平方米或(平方厘米)GY-1果实硬度计使用方法测量前：转动表盘，使驱动指针与表盘的第一条刻度线对齐（GY-1型的为刻度线2，GY-2和GY-3型的为刻度线0.5）；将待测水果削去1平方厘米左右的皮。测量：用手握硬度计，使硬度计垂直于被测水果表面，压头均匀压入水果内，此时驱动指针开始驱动指示指针旋转，当压头压到刻度线（10毫米）处停止，指示指针指示的读数即为水果的硬度，取三次平均值。测量后：旋转回零旋钮，使指针复位到初始刻度线。电导率： 电导率仪测定（DDS-12A 型数字式电导率仪） 使用方法：1. 量程选择 共5挡，分别是2 S/cm、20 S/cm、200S/cm、2 mS/cm、20 mS/cm，档位数字为该挡的最大测量值，电导率仪超过此数字时不再显示数字，应该换档。使用高周时需同时按下20 mS/cm及200S/cm档位。读数超过200S/cm时用高周，超过2 S/cm时用DjS-10型Pt黑电极。2. 电容补偿 用以抵消电极连接的电容器。在接有电导电极但电极未浸入溶液时，按下2 S/cm挡按钮，用电容补偿调节器调零。3. 常数调节 用调节器调节至与电容常数一致。4. 温度补偿 通常置于25。测定是将电极插入测定液，按下相应的档位即可读数。丙二醛含量：硫代巴比妥酸比色法 公式： C（mol/L）=6.45（A-A）-0.56A 式中：A、A、A分别代表450nm、532nm和600nm波长下的吸光度值。用公式可直接求的植物样品提取液中MDA的浓度，进一步算出其在植物组织中的含量。 材料、仪器、试剂： 材料：所选植物材料 仪器：研钵、试管、可调加样器、恒温水浴锅、冷冻离心机、分光光度计。 试剂；15%三氯乙酸（TCA）。20.67%（W/ V）硫代巴比妥酸（TBA） 用10%的TCA配制。 步骤：1. 取0.5g植物样品，加5%TCA 5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min 下离心10min。 2. 取上清液2 ml，加0.67%TBA 2 ml，混合后在100水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。 3. 分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。并按照公式算出MDA浓度。多酚氧化酶活性：多酚氧化酶活性；儿茶酚比色法 器材与试剂1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计2、试剂：儿茶酚、pH 4.6磷酸缓冲液3、材料：所用实验材料实验步骤：1称取实验材料0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4 5000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。2在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。3A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。4计算酶活力。按下式计算PPO活性U/min gFW A值增加0.001定义为一个酶活力单位。 计算所测材料的PPO活性。选择A值变化均匀的三组数值求平均值。过氧化物酶活性：愈创木酚比色法材料、仪器、试剂： 材料：所用实验材料。 仪器：可见光分光光度计；离心机；研钵；容量瓶；量筒；试管；吸管。 试剂：0.05mol/LpH5.5磷酸缓冲液；0.05mol/L愈创木酚；2%HO；20%三氯乙酸。实验步骤：（一） 酶液的制备 取5.0g洗净去皮的实验材料，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆全部转移到离心管中，于3000rmp离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。（二） 过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包：0.05mol/L磷酸缓冲液2.9ml，2% HO1.0ml，0.05mol/L愈创木酚1.0ml和1.0ml酶液。用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2.0ml终止反映，然后过滤（或5000r/min离心10min），适当稀释，470nm波长下测定吸光度。结果计算： 以每分钟A变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）过氧化物酶活性【U/（gmin）】=（AV）（WV0.01t）式中：A为反应时间内吸光度的变化：W为实验材料鲜质量（g）；t为反应时间（min）；V为提取酶液总体积（ml）；V为测定时取用酶液体积（ml）。过氧化氢酶活性：紫外吸收法 材料、仪器、试剂； 材料：所用实验材料 仪器：研钵、离心机、250ml容量瓶、移液管（0.5ml、2ml各2支）、10ml试管3支、恒温水浴、紫外分光光度计。 试剂：0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L HO（使用前用0.1mol/L高锰酸钾标准液标定） 实验步骤：（一） 酶液提取取小麦叶片0.5g加入23ml 4 下预冷的pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液至容量瓶中并定容至刻度。混合均匀后将容量瓶置 5 冰箱中静置10min，去上部清夜4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗体液，5下保存备用。（二） 酶活性测定 取10ml试管3支，其中2支样品测定管，1支为空白对照管，按下表顺序加入试剂。将S1号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25下预热后，逐管加入 0.3ml 0.1mol/ml的HO，每加完一管立即计时，并迅速导入石英比色皿中，在240nm下测定吸光度，每间隔1min读数一次，共测4min，待三支试管全部测完后，计算酶活性。计算结果： 以每分钟A减少0.1的酶量为1个酶活性单位（U）。 过氧化物酶活性【U/（gmin）】(AV)/(0.1VtW) 其中A=A-（A+A）/2式中：A为加入煮死酶液的对照管的吸光度；A、A为样品测定管的吸光度；V为提取酶液总体积（ml）；V测定时所用酶液总体积（ml）；W为样品鲜重（g）；t为从加HO开始到最后一次读数的时间（min）；0.1为A下降0.1时的1个酶活性单位（U）SOD超氧化物歧化酶活力测定： 材料、仪器、试剂： 材料：所用实验材料； 仪器：高速台式离心机、分光光度计、微量进样器、荧光灯（反应试管处光照为4000Lx）、试管或指形管树支 试剂：1. 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）2. 130mmol/L甲硫氨酸溶液 称1.9399g甲硫氨酸用磷酸缓冲液定容至100ml3. 750mol/L氮蓝四唑溶液 称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存4. 100mol/L EDTANa溶液 称取0.03721g EDTANa用磷酸缓冲液定容至1000ml5. 20mol/L核黄素溶液 称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 实验步骤：1. 酶液提取 取实验材料0.5g于预冷的研钵中，加入1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.52.0ml于4000r/min下离心10min。上清液即为SOD粗提液。2. 显色反映 取5ml指形管4支，2支为测定管，另外2支为对照管，按下表加入试剂（酶）用量/ml终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L甲硫氨酸溶液750mol/L氮蓝四唑溶液100mol/L EDTANa溶液20mol/L核黄素溶液酶液蒸馏水总体积1.50.30.30.30.30.050.253.013mmol/L75mol/L10mol/L2.0mol/L2支对照试管以缓冲液代替酶液 混匀后将1支对照管放在暗处，其他各管于4000Lx日光下反应20min（要求各试管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）3. SOD活性测定 至反映结束，以不光照的对照管做空白，分别测定其他各管的吸光度 结果计算：已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位（U）表示，按下式计算 SOD总活性（U/g）=（A-A）V/AWV 式中：A为照光对照管的吸光度；A为样品管的吸光度；V为样品液总体积；W样品鲜重；V为测定适样品用量抗坏血酸含量的测定：（比色法） 材料：所用实验材料 仪器：722型分光光度计、容量瓶、研钵、不锈钢刀、具塞大试管 试剂：1%草酸；2%草酸；30%硫酸锌；15%亚铁氰化钾；染料溶液（称100mg2，6-二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于60ml热水中，过滤定容至100ml容量瓶中放入棕色试剂瓶于冰箱中。用时稀释4倍，每ml约为0.1mg维生素C）；抗坏血酸标准溶液（0.05mg/ml）（100mg分析纯抗坏血酸，溶于1%草酸中。定容至100ml，再吸出5ml，用1%草酸再稀释至100ml）；二甲苯（分析纯） 实验步骤：1. 标准曲线 取具塞大试管6个，分别吸抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至4ml，各市观众加入染料溶液2ml，随即加入二甲苯5ml迅速摇动0.5min，静置后二甲苯与水层分离，将二甲苯萃取液倒入1cm比色杯中500nm波长下求测吸光度值。2. 样品提取 去2g样品放在研钵中，加入3ml2%草酸研磨至匀浆，将匀浆倒入100ml容量瓶中，残渣用1%草酸冲洗，都倒入容量瓶中，加入1ml30%硫酸锌，摇动容量瓶，再加入1ml15%亚铁氰化钾以除去脂溶性色素，再用1%草酸定容至刻度线，摇匀后过滤到干净的烧杯中。3. 测定 取上述提取液4ml至具塞大试管中，依次加入染料2ml，二甲苯5ml，按照标准曲线的方法测定吸光度 结果计算： 每百克鲜样的抗坏血酸含量（mg/100g）=（XV/ WV）100 式中：X-4ml提取液中含抗坏血酸的mg数；V-提取液总体积；W-样品鲜重；V测定用样品体积抗坏血酸过氧化物酶（AsA-POD）活性测定 仪器：离心机、紫外分光光度计、研钵、试管 试剂：50 mmol/L KHPOKHP O缓冲液（pH7.0，内含1.0mol/L EDTANa）；0.3mmol/L AsA；20mol/L AsA;0.06mmol/LHO 方法： 1. 酶液制备 取1.0g实验材料，按1：3（W/V）加入预冷的50mmol/L KHPOKHP O缓冲液进行研磨提取，用2层纱布过滤，滤液离心（4000g）10min，上清液做酶粗提取液供测定 2. 酶活性测定 3ml反应混合液中含50mmol/L KHPOKHP O缓冲液（pH7.0），0.1mmol/L EDTANa，0.3mmol/LAsA, 0.06mmol/L HO和0.1ml酶液。加入HO后立即在20下测定1030秒内的A变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性谷胱甘肽含量测定 主要材料：实验材料、还原性谷胱甘肽标准样品、邻苯二甲醛、蒸馏水。荧光分光光度计、离心机、电子天平。 测定方法：1. 标准溶液配置： 精确称取谷胱甘肽标准样品100mg，用去离子水定容至100ml，转移0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml到五个100ml容量瓶中，再分别用去离子水定容至刻度。得到0.005、0.01、0.02、0.03、0.04（mg/ml）的谷胱甘肽溶液各100ml（临用现配）。2. 邻苯二甲醛溶液配置： 将50mg邻苯二甲醛溶解在甲醇中配成1.0%的溶液，放入4的冰箱中备用3. 标准曲线制作： 在荧光分光光度计上，用365nm作为激发波长，在390500nm之间进行荧光发射光不扫描，确定最大发射波长（419.5nm），在该波长处测定浓度最大的标准溶液和空白溶液的荧光值，设定数据刻度和本底扣除值，将仪器选择为浓度测试功能，将配置好的标准GSH溶液用419.5nm作为发射波长、带宽为3nm，测定荧光值，制作标准曲线。4. 样品的预处理： 取试验样品10g捣碎，汁液进行离心10min后分离，在上清液中加入25%的HPO溶液，供络合反应用5. 络合反应： 室温下，用移液管移取2ml样液在比色管中，再用另一移液管取2ml邻苯二甲醛溶液，再加入0.2mlPH=8的磷酸缓冲液，在暗处反映1min后测定荧光强度。谷胱甘肽还原酶活性： GR活性1.酶液的提取： 称取研磨成粉状的组织材料0. 5 g, 加入5 mL 的50 mmol/LTris-HCl 提取液( pH 7. 0, 其中含有20% ( V/ V ) 的甘油, 1 mmol/L AsA, 1 mmol/L EDTA, 1mmol/L- 1 DTT 和5 mmo l/L MgCl ) , 混匀后在4 、12 000 g 下离心