细胞培养学笔记(3).doc

细胞培养学笔记（3）一、正常细胞培养1.上皮细胞类培养:来源于外、内、中三个胚层。上皮细胞培养有三个难点:需求特殊底物,如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长;需求特殊培养基;与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长,并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。a.表皮细胞培养:(1)取材:切成0.5-1cm2小块;(2)EDTA处理:室温置5分钟;(3)冷消化:换入胰蛋白酶中,置4过夜;(4)分离:取出皮块表皮与真皮层分开;(5)温消化:表皮剪成更小的块后,置入新的胰蛋白酶中,37再消化30-60分钟;(6)用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液;(7)培养液:过滤,离心,吸上清,直接加入Eagle液和血清,制成细胞悬液,接种入培养瓶中培养。b.乳腺组织培养:(1)直接培养法:适于培养含纤维少的软组织,在含有少量培养液的容器中,将组织切割成碎块,注入离心管中,补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架中3-5min。吸除上层液可排除非腺细胞成分,重复2-3次,末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,立即滤入另管中,调整密度,接种入培养瓶中培养。(2)胶原酶消化法:适于处理含纤维多的较硬组织,其过程与培养其它组织相同。c.胃上皮细胞培养:(1)取材:取远端非病变区粘膜少许;(2)清洗:含庆大霉素和二性霉素的Hanks液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成lmm3大小;(3)消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,37消化80min; (4)离心:收集细胞悬液,离心,Hanks液漂洗两次;(5)接种:接种入培养板中;在16小时内贴壁,细胞呈多角形,岛状或片状生长,以后逐渐联接成片。初代培养可维持2-3周,第一周末达高峰,最后逐渐衰退剥落。d.肝细胞培养：初代组织块培养:取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,剪成1mm3左右的小块,采用贴壁培养法。一般次日即可出现生长晕。初代消化法培养:(1)把肝组织切成2-4mm3的小块,用不含钙镁的BSS液洗两次;(2)移入1:1胰蛋白酶和胶原酶中,4冷消化10-12h后,过滤;(3)收集细胞:BSS液洗、计数、接种培养;灌流法:(1)无菌解剖动物,取出肝脏,BSS洗;(2)吸取消化液后,把注射器头插入肝管中,结扎牢固,以防漏出,注入胆管系统,使消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20-30分后,吸出消化液的同时并轻柔压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出;(3)待吸净消化液后,注入离心管中,离心,用RPMI1640培养基培养,能获得较纯的肝上皮细胞。传代培养:待细胞生长连接成片后,用BSS洗,加1:1的0.025%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化3-5min,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗,接种培养。e.内皮细胞培养:灌流消化法:(1)取新鲜脐带,可保存于4中,但不宜超过12小时,无菌剪取长10-15cm;(2)先用三通注射器吸温PBS注入脐静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流;(3)用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉注入终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化3-10min;(4)吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,可再冲洗2-3次,一并注入离心管中离心;(5)接种入培养瓶中培养,顺利时2-3天内细胞即可长成单层。f.毛细血管内皮细胞初代培养:(1)取材:取牛肾上腺数个,用Hanks除血污;(2)除被膜,分离皮质,切成1mm3小块,加0.5%胶原酶室温消化1h;每隔10min吹打令消化充分;(3)过滤,网眼只允许通过小于110m的毛细血管小段;(4)离心,弃上清,共两次;末次用Eagle氏培养液重悬;(5)接种入铺有明胶底层的培养皿中,37培养;前1-3h,毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮;(6)吸除培养液,加入条件培养液;每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1-4个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2-5天。毛细血管内皮细胞分离培养:(1)初代培养2-3天后,在培养皿背面,圈记毛细血管内皮细胞岛;(2)如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在镜下挑除,时间不宜过长;圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除;(3)用培养液漂洗,以去除漂浮细胞;(4)剩余内皮细胞岛如少时,生长增殖常变得缓慢,此时需加入饲细胞;(5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入条件培养基;(6)接种入明胶底物皿中继续培养,细胞增殖生长汇合后,传代。2.结缔组织细胞培养a.成纤维细胞培养:用人或动物胚体为好。动物可用小鼠或鸡胚,去头和内脏,剪成小碎块后。用胰蛋白酶消化法培养;如为人胚,可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。b.巨噬细胞培养:来源和取材:人胸水、腹水、血和透析液等;动物血液、肺、脾和胸腹腔,一个小鼠腹腔中,就含有2-3106个。纯化和分离:大多数单核巨噬细胞有极易附着于玻璃表面的特性;用不加防腐剂的纯利多卡因处理, 37作用5min。培养方法:(1)实验前三天,腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml;(2)引颈杀死动物; 70%酒精消毒;(3)针头固定四肢,暴露出腹膜,但勿伤及腹膜壁;(4)用注射器吸lOml Eagle液注入腹腔中,同时从两侧用手指揉压腹膜壁,令液体在腹腔内充分流动;(5)使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内;(6)离心10分钟,去上清,加Eagle培养基;(7)计数细胞;(8)为获取3105个贴附细胞/cm2,需接种2.5106 /ml;(9)为纯化细胞,接种数小时后,去除培养液,用Eagle液冲洗,加新Eagle液, 培养。3.肌组织细胞培养骨骼肌细胞培养:(1)无菌取大腿肌,切成0.3-0.5cm;(2)胰蛋白酶消化,过滤,合成培养基加血清培养,为促进分化可加1%的胎汁;(3)细胞接种量为2106/皿;接种在胶原或明胶的底物上能促进细胞分化。心肌细胞培养:(1)受精鸡卵,温育,每日翻动一次,孵育9-12天;(2)取鸡胎;剥出心脏,置入皿中用Hanks液洗;(3)小心剪除大的动静脉,保留心室肌。用组织块或消化培养法均可。4.神经组织细胞培养培养方法:(1)剥除脑组织纤维成分,漂洗,置于Hanks液中;脑组织比较柔软,反复吹打即制备成细胞悬液;(2)把悬液注入离心管中,室温5-10分钟后,细胞或细胞团块自然下沉,脂肪等杂物易漂浮于悬液表层,吸除上清,可获较多的细胞成分;(3)向末次沉降物中加入适量营养液,过滤,计数细胞并调整好细胞密度,接种,培养;(4)细胞生长汇合后,可用胰蛋白酶消化传代。二、培养细胞的分化1.不适应:细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显2.脱分化或去分化:即细胞失掉发生分化的能力。 不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑;从分子水平考虑,脱分化很可能是基因变异所致,因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和分化因子的缺乏,导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完全丧失。三、培养细胞形态分类 1.贴附型 :只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞。当细胞贴附在支持物上之后,易失去它们在体内时原有的特征,细胞分化现象常变得不显著。在形态上常表现单一化的现象,并常反映其胚层起源,呈现类似前述“反祖现象”。如来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型;来自中胚层的则易呈成纤维细胞型,显然与细胞分化有关。由于上述原因,体外培养细胞形态常表现有一般化的倾向。因此在判定培养细胞形态时,很难再按体内细胞标准确定。a.成纤维型细胞:本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名;细胞体呈梭形或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间充质起源的组织,如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等呈本类形态。b.上皮型细胞:本型细胞具有扁平不规则多角形,中有圆形核,细胞紧密相连成单层膜。起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织培养时,皆呈上皮型形态。上皮型细胞生长时,尤其是外胚层起源的细胞,细胞之间常出现所谓“拉网”,即在构成上皮膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲,致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞。拉网的形成可能与细胞分泌透明质酸酶有关。c.游走型细胞:本型细胞在支持物上散在生长,一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起,呈活跃的游走或变形运动,速度快而且不规则。此型细胞不很稳定,有时亦难和其它型细胞相区别。d.多形型细胞:除上述三型细胞外,还有一些组织和细胞,如神经组织的细胞等,难以确定它们规律的形态,可统归入多形型细胞。2.悬浮型:有的细胞在培养时不贴附于支持物上,而呈悬浮状态生长,如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。细胞悬浮生长时,胞体为圆形,观察时不如贴附型方便。其优点是细胞悬浮在培养液中生长,生存空间大,容许长时间生长,能繁殖多量细胞,便于做细胞代谢等研究。四、培养细胞形态结构1.大体形态:悬浮生长:胞体基本呈圆形贴附于支持物开始为圆形,很快经形态演变过渡扁平形态。附于球体表面时,细胞与球体呈同心圆,支持物表面平坦时,则细胞先由圆形延展成圆饼形,此时的细胞可称之为放射延展细胞,其细胞质可区分为:中心区或内质外质或板层区:活跃与不活跃部分。放射延展细胞持续0.5-2h过渡为极性细胞。当细胞相互接壤成片后,极性常变得不明显,外质周边部也无明显活跃部分与不活跃部分的区别。2.超微结构:电镜观察细胞膜分为三层结构,双层类脂分子组成;细胞膜向外凸出形成微绒毛;即使细胞连接成片时,在细胞之间仍存在着一定的间隙;细胞相互接触部并可见到桥粒,桥粒的有无可作为识别上皮细胞的标志;细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜,即细胞外衣,它对细胞的运动,尤其对细胞贴附于支持物生长有很大作用;微丝存在于细胞膜下面的胞质区膜下皮质层;细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质。3.细胞骨架观察(CSL):细胞骨架(微丝和微管)是细胞质中重要结构之一,与细胞运动以及细胞转化有密切关系。鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法:(1)盖片培养细胞(70%-80%汇合),PBS洗3次;(2)2%的甲醛/PBS液(甲醛按37%)固定3min;(3)0.5%三硝基甲苯/PBS处理3次,每次10min,PBS洗3次;(4)用罗丹明标记的鬼笔环肽(1:10)室温中反15min,PBS洗3次;(5)60%甘油十荧光防淬剂封片,荧光显微镜检。抗管蛋白免疫染色法:微管主要成分为蛋白(1)支持物培养法,培养在盖片上,PBS中洗330s;(2)3%甲醛液固定20min,PBS洗31min,吸干多余PBS;(3)冷丙酮(-10-20),令细胞面向上,作用7min,PBS中洗31min,吸干多余的PBS;(4)直径6cm碟皿,中央滴浓度为0.1-0.2mg/ml的一级抗管蛋白抗体,细胞面向下,置37温箱中45min至1h;(5)令盖片浮在PBS液面,用镊子挟出,PBS洗;(6)二级荧光抗体处理:按(4)进行,漂洗(7)封片,荧光显微镜下观察。考马斯亮蓝:(1)支持物盖片培养,戊二醛固定15min,蒸馏水漂洗;(2)考马斯亮蓝液中染色60min,漂洗;(3)分化:置入含甲醇冰醋酸液中,微丝逐渐明显,终止;(4)漂洗,脱水,各度酒精,二甲苯,树胶封片。细胞内微丝呈蓝色,如分化较好时背地清亮,反之会影响微丝的清晰度。五、组织培养细胞的生长和增殖过程1.组织培养细胞生命期:是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。细胞生存过程中经历以下三个阶段:a.原代培养期:也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。细胞群是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强,由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药物很好的实验对象。b.传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下,细胞增殖旺盛。并能维持二倍体核型,呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质,应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代30-50次后,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第三期。c.衰退期: 此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。在少数情况下,以上三期任何一点,由子某种因素的影响,细胞可能发生自发转化,转化的标志之一是细胞可获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系,也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末,或第三期初阶段。细胞获不死性后,核型大多变成异倍体,细胞转化亦可用人工方法诱发,转化后的细胞也可能具有恶性性质。2.组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词,仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间,细胞传一代后,一般要经过三个阶段。a.潜伏期:先经过悬浮期,此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是贴壁,悬浮期结束。细胞贴附支持物后,除先经过前述延展过程变成极性细胞,还要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有运动活动,基本无增殖,少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长,约24-96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅6-24小时;细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标志细胞已进入指数增生期。b.指数增生期:细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数(MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,初代细胞分裂指数低,连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%-5%(肿瘤细胞偏高)。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期,因此是进行各种实脸最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3-5天后,随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。生长曲线测定:接种21孔/24孔板细胞,分7组,每组3孔,培养一周(7天),期间逐日检测一组,计数,最后把7天中的细胞数值绘成图,即为细胞生长曲线。(1)悬液制备(2)接种(3)计数检测(4)绘图:用座标图纸绘成生长曲线细胞分裂指数(MI):待取得逐日分裂相数值后,也可绘成细胞分裂指数曲线。注意,细抱分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致,但不完全相同,如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后,细胞数值很大,而分裂相可完全消失。接种存活率和克隆形成率:2-5个细胞/cm2被接种到底物上,贴壁并能存活生长形成细胞小群的细胞百分数值称接种存活率,用以表示细胞群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆(通常为16-50个细胞)形成情况,又因每个克隆都来自一个细胞,因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比.六、细胞增殖动力学:1.增殖态:增殖态即细胞进行增殖的状态或过程;细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂。细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制;两者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成后,细胞才能发生分裂;而细胞有丝分裂所完成的主要是细胞质和细胞核的分配。以上三个基本过程是细胞增殖态主要的活动,三个过程有阶段性,又相互依存。a.G1期:细胞分裂后期,或DNA合成前期,G1期是细胞质复制的主要阶段,细胞进入G1期标志细胞已进入增殖态。上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入G1期,取决于外源生长因子和其它增殖相关因子的调控。在G1期中,接受外界因子影响的特定阶段,称调节点。培养细胞属旺盛增殖细胞群体,一般具有较短的G1期,衰退细胞持续时间长。G1期主要为细胞内的蛋白质合成、RNA合成、多聚核蛋白体合成增多等;G1期胞体逐渐增大,是镜下唯一可感知的变化。b.S期:即DNA合成期,主要机能活动为进行DNA合成。各种细胞DNA合成持续时间差别不大,比较恒定,平均6-8h,除用抑制DNA合成药物如5-氟尿嘧啶等外,细胞一旦进入S期,DNA合成过程一经开始,大多能持续进行,独立性较大,对环境不利因素有一定耐受能力。但DNA在进行合成时,多核苷酸双链发生分离,在此阶段,易受致突变或致癌因素作用,DNA合成期是遗传物质易受致突变物损伤的时期。c.G2期:发生在DNA合成后和本次细胞分裂期之前,故也称DNA合成后期或细胞分裂前期。细胞进入G2期后,DNA含量已加倍,具有4倍量的DNA。在G2期主要的变化是与细胞分裂相关的RNA的合成和染色质的螺旋化。本期持续时间较短,平均2-5小时。G2期对外界环境敏感,易受温度、pH及各种其它因素的影响而受阻不能进入M期,但不利作用消除后却能很快恢复。d.M期:即细胞有丝分裂期,培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。M期结束形成两个子细胞,是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相,在生活状态下可以直接观察到,培养细胞是研究细胞有丝分裂过程理想的对象,细胞分裂过程分前中后末四期,活细胞分裂过程表现如下:前期:细胞核发生转动可能是前期的开始。当染色体在核中出现并愈来愈清楚时,证明细胞已进入分裂前期。稍后,核膜和核仁突然解体消失,染色体混于细胞质中并呈现活跃的运动。同时从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起,它们此起彼伏犹如液面沸腾。此时细胞质逐渐回缩,细胞体趋于变圆,遂与底物附着面减少,易脱落入培养液中,染色体由分散状态渐向细胞中央部移动,然后突然“冻结”于赤道平面,到此前期结束,中期开始,前期持续时间20-30分钟。中期:胞质进一步回缩,胞体呈圆球形,与支持物附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁,在培养液的冲击下,细胞极易从瓶壁脱落,依此可作为收集中期分裂相的简易方法。染色体集中于赤道平面后,失去明显的运动,中期染色体集聚在赤道平面上称中期板。细胞分裂中期持续20-30分钟min,本期细胞对外界因素敏感,易受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。后期:一且中期板染