原位核酸分子杂交技术.doc

原位核酸分子杂交技术第一节 原位核酸分子杂交技术的发展 第二节 原位杂交技术的基本方法 (一)固定 (二)玻片和组织切片的处理 (三)杂交 (四)杂交后处理 (五)显示 (六)对照实验和结果的判断 第三节 原位DNA和DNA分子杂交方法 (一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法 (二)生物素标记HPV-DNA探针在石蜡切片上检测HPV-DNA的方法 第四节 RNA原位核酸杂交方法 一、基本原理 二、 RNA原位杂交中探针 (一)探针种类 (二)探针标记 (三)探针的纯化 (四)杂交前准备 (五)杂交前探针的选择 三、 cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交 (一)组织的前处理 (二)RNA探针的标记 (三)预杂交 (四)原位杂交 (五)杂交后处理 (六)杂交后显色 四、用寡核苷酸探针检测组织中的 RNA原位杂交 (一)组织的前处理 (二)杂交预处理 (三)寡核苷酸探针选择和标记 (四)预杂交 (五)杂交 (六)杂交后处理 (七)免疫检测及显色 (八)阳性信号的评定 (九)原位杂交的对照 五、用 cDNA探针检测体外培养细胞中的RNA原位杂交 (一)细胞的准备、固定和细胞的通透 (二)原位杂交 (三)杂交后洗脱 (四)免疫荧光检测 六、 RNA原位杂交现状和进展 (一)组织前处理的改进 (二)杂交的信号放大 (三)RNA原位杂交与免疫组化双重检测技术 (四)多重RNA原位杂交技术 第五节 地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法第六节 原位杂交结合免疫细胞化学双标记法 一、杂交、免疫组织化学方法 二、免疫细胞化学 -杂交结合方法 三、对照 第七节 双重原位杂交方法 一、放射性探针与生物素探针结合双重杂交方法 (一)一步法 (二)二步法 二、非放射性探针的双重原位杂交方法 (一)双重荧光探针原位杂交方法 (二)生物素和地高辛标记探针的双重原位杂交方法 第八节 原位杂交的 PCR增敏法 第九节 原位杂交的 CSA增敏法 第十节 原位核酸分子杂交的试剂 一、特异性的探针试剂 二、探针标记 三、原位杂交信号的检测试剂 四、成套原位杂交检测试剂盒 五、如何选择原位杂交试剂 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交 (in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。第一节 原位核酸分子杂交技术的发展 原位杂交 1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno Nardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂信号。 Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同又可分为 DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核甘酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single stranded,ssDNA)和双链DNA(Double stranded,dsDNA)之分。所以原位杂交可分为DNA-DNA，cDNA-RNA,RNA-RNA和寡核苷酸探针与DNA或RNA等杂交方式。原位杂交技术在生命科学的研究中可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展 . 第二节 原位分子杂交技术的基本方法 原位杂交技术的基本方法包括：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；杂交；杂交后处理；显示 (visualization)：包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。 (一)固定 原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的 DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。 DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。 1最常用多聚甲醛固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。 2醋酸酒精的混合液和Bouins固定剂也能获得较满意的效果。 3mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 4组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在-70。如冰箱温度恒定，在-70切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存 RNA，而且对组织结构有损伤。 戊二醛较好地保存 RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。 (二)玻片和组织切片的处理 1玻片的处理 玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡 24 h，清水洗净烘干， 95%酒精中浸泡24 h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。 要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾明胶液，其优点是价廉易得，粘附效果较差。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵。一种新的粘附剂 APES粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。 2增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂 (detergent)或称清洗剂Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应填为掌握。蛋白酶K(Proteinase K)的消化作用的浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用蛋白酶K 1g/ml(于0.1 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37孵育1520 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，Burns等(1987)报道应用胃蛋白酶(Pepsin)20100 g/ml(用0.1 N HCl配)37、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。 3减低背景染色 背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后 (Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐 (acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。预杂交 (Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖 (Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 在杂交后洗涤中采用低浓度的 RNA酶溶液(20g/ml)洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA酶，减低背景染色。 4防止RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有 RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温 (240 )烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必需在150左右。(三)杂交(Hybridsation) 杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将复有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量 5SSC或2SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。 (四)杂交后处理(Post hybridisation treatment) 杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。 RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的 RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。 (五)显示(Visualization) 显示又可称为检测系统 (Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪 (computerassisted image analysis)检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图象分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。但做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的间隔时间等。如为放射自显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。 (六)对照实验和结果的判断 对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种。 1将cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。 2与非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。 3将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交。应用同义RNA探针(Sense probe)进行杂交。 4以不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)。 5组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。 6应用未标记探针做杂交进行对照。 第三节 原位 DNA和DNA分子杂交方法 DNA探针在病毒的检测等领域中得到广泛的应用。杂交时需先在高温 8095短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅速置于冰上冷却。然后置于3742杂交过夜。 (一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法 1组织切片的预处理 (1)固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚46 m，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱 6080 68 h，使切片更紧粘贴于玻片。 (2)脱蜡：二甲苯10 min2,自100%乙醇和， 95%，90%，70%，50%，30%各5 min。入PBS(含5 mmol/L MgCl2,pH7 37 4) 5 min2。 (3)入0.2 mmol/L HCl 20 min以去除蛋白。 (4)50 2SSC,含5 mmol/L EDTA溶液中30 min。 (5)蛋白酶K(1g/ml溶于0.1 mol/L PBS中)，37 2025 min。 (6)0.2 mol/L甘氨酸液：室温10 min,中止蛋白酶反应。 (7)4%多聚甲醛(PBS新鲜配制),室温20 min。 (8)PBS/5 mmol/L MgCl2漂洗10 min2。 (9)脱水，自低浓度到高浓度至无水乙醇各3 min，空气干燥。 2预杂交封闭非特异性杂交位点，加预杂交液 20 l/每张切片，42水浴半小时。 3杂交加杂交液 1020 l/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95 10 min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上 1 min，再将切片置于盛有2SSC湿盒内，42过夜(1618 h)。 4杂交后漂洗 (1)2SSC液内振动移除盖片。 (2)2SSC 55 10 min2。 (3)0.5SSC 50 5 min2。 (4)缓冲液(含05%封阻试剂，用缓冲液溶解)37 30 min。 (5)缓冲液(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室温。 (6)酶标地高辛抗体(15 000，应用缓冲液解释)37 30 min。 (7)缓冲液 15 min2，室温。 (8)缓冲液(100 mmol/L TrisHCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温，2 min。 5显色 (1)显色液配制：在缓冲液 1 ml中加入45l四氮唑蓝(NBT)，35l X磷酸盐(5溴-4-氯-3吲哚磷酸盐(BCIP)配成。30l/每张切片，置暗处显色(30 min到2 h。定时抽查切片，镜检其显色情况。 (2)缓冲液(10 mmol/L TrisHCl,1 mmol/L EDTA,pH80) 10 min终止反应，用核固红或甲绿复染5 min，二甲苯透明，DPX封固，镜检。 6结果杂交阳性信号呈紫兰色，细胞核呈红或绿色。 (二)生物素标记HPV DNA探针在石蜡切片上检测HPV DNA的方法。 1玻片的预处理 组织细胞原位核酸杂交主要在载玻片上进行，因此玻片的处理至关重要。载玻片 (或盖玻片)一般要经过 1 mmol/L HCl溶液或重铬酸钾硫酸溶液的浸泡，取出后充分用自来水冲洗，用双蒸水洗三遍，然后置于 60烤箱中烤干。将烤干的玻片分别插在染色架中，置250烤箱中烘烤 4 h，目的是去除玻片上残留的核酸酶。为了防止组织或细胞在杂交过程中脱落，原位核酸杂交所需的玻片必需进行硅化处理。把经过 250烘烤过的玻片用2% 3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液处理玻片，有助于组织和载玻片的粘附。APES对甲醛固定的组织粘附效果好，可使组织与载玻片发生共价结合。 玻片硅化方法： (1)室温下将高温处理过的载玻片用2% APES丙酮液浸泡3 min；(2)用丙酮洗去多余的APES；(3)用DEPC处理的蒸馏水或高压消毒的蒸馏水清洗玻片12次；(4)40烤干玻片，防污保存在干燥器皿中待用。整个处理过程均要戴消毒手套进行操作。2组织切片 常用的原位杂交标本有石蜡切片、冰冻切片和细胞培养标本。无论是哪一类的标本，在制备时都要尽量避免 RNase污染。操作时要戴手套，要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀、镊子等。石蜡切片时，展片要用高压消毒处理过的蒸馏水，裱片后把切片置 60烤箱中烤片13 h。置室温下保存备用。新鲜组织切片最好先用固定剂固定(如用4%多聚甲醛或冷丙酮固定10 min)，吹干后-70保存或在70%酒精中4保存，培养细胞标本的处理方法与冰冻切片法相似。 3杂交前处理 目的在于提高组织的通透性 ,以防止DNA探针与细胞、组织之间的非特异结合，以增强杂交信号 ,减少背景着色。 (1)脱蜡 石蜡切片必需充分脱蜡 ,因为石蜡未脱净会影响探针的穿透力,因而脱蜡用的二甲苯尽可能新鲜。常规石蜡切片用二甲苯脱蜡 3次,每次5 min;脱蜡后用逐级梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗,然后用蒸馏水洗3 min,必须用高压处理过的蒸馏水。 (2)蛋白酶处理 蛋白酶的消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露,以增加探针与靶核酸结合的机会。常用的蛋白酶有蛋白酶 K(proteinase K)、链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)、蛋白酶BP等。 蛋白酶的浓度及消化时间 ,视组织种类、固定类型、切片厚度而定,一般使用1 g/ml蛋白酶K(用含50 mmol/L EDTA的pH80,01 mol/L TrisHCl缓冲液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80 PE配制)37孵育1030 min。蛋白酶具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用,促进探针渗透,从而提高杂交信号。但过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及靶核酸的减少,也会导致标本从载玻片上的脱落。 4杂交反应 (1)变性和杂交 进行杂交反应时 ,探针和靶核酸都必须是单链。如果用双链cDNA探针检测,则探针和靶核酸都必须先解链 ,也就是变性。将生物素标记的双链探针杂交液滴在待检组织上,然后加盖经 250高温处理过的盖玻片,勿产生气泡,并在盖玻片周边用石蜡油封边(目的是防止探针和杂交液在杂交过程中蒸发),将含有探针的载玻片放入已经加热煮沸(95100)的水浴箱的密封盒中(容器底部预先加入适量的蒸馏水)变性510 min。探针和靶DNA同时变性,变性的单链探针与靶DNA随即进行杂交反应。如果用单链探针与靶DNA进行杂交,虽然探针本身并不需要变性,但也可将探针加在组织标本上,用上述方法使靶DNA变性。变性完毕将切片放在冰块上迅速降温12 min,然后将切片移入湿盒内置37培养箱杂交60 min。如有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交,先调整好原位杂交仪的变性、杂交时间和温度,将玻片放入杂交仪内进行变性杂交,当杂交仪升温至95时即可进行变性,变性后温度迅速下降到37时即可进行杂交反应。 (2)杂交后漂洗 其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针 ,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色 ,增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒 (或杂交仪)中取出,用2SSC将盖玻片洗脱,2SSC 30洗2次,每次15 min;1SSC 42洗2次,每次15 min;05SSC 37洗2次,每次15 min,TBS缓冲液洗2次。注意在漂洗过程中切不要使切片干燥。 (3)杂交信号的检测 探针与靶核苷酸结合形成杂交体 ,对其检测的方法因探针的标记物不同而异,一般与免疫组化方法类似 ,当带有酶的抗半抗原抗体(或者抗生物素蛋白)通过搭桥(或直接)与探针连接后,催化底物混合液中的底物发生反应,使其产生有色沉淀物即为阳性反应。现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体(或抗生物素蛋白)连接进行检测。在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素(streptavidin alkaline phosphatase conjugated)溶液,室温孵育2040 min,TBS缓冲液洗3次5 min,加入BCIP/NBT室温暗处显色1030 min,TBS缓冲液洗,01%核固红复染切片5 min,蒸馏水冲洗,酒精脱水,中性树胶封片。 (4)杂交结果 DNA原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位,一般在细胞核内,呈紫蓝色颗粒状,若靶基因数量多或显色时间长,则整个细胞核呈浓染蓝色,阴性细胞核呈红色。 (5)对照试验 阳性对照 :用已知含靶核酸序列的组织作对照。 阴性对照 :用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。 用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。 省略标记探针。 DNA酶消化靶DNA对照。 HJ1(6)非特异性染色 非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等 ;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因 ,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3% H2O2处理510 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。 第四节 RNA原位核酸杂交方法一、基本原理 RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交6,7,25 (RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合 (杂交 )，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的 mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有：(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。(3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位，而DNA原位杂交则难以信任。但RNA原位杂交也存在某些不足之处，为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点：(1)不同探针种类的选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；(2)有效制止组织和细胞内RNA降解；(3)实验流程中严防RNA酶污染；(4)对杂交信号有效的放大和显色技巧；(5)阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件的更需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。(6)在实验流程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证RNA原位杂交成功的必要条件。近几年来RNA原位杂交已得到稳步发展。主要表现在：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位杂交中应用等。从理论上讲，RNA原位杂交已趋成熟和完善，关键是在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中，促进人们对各类基因识别和表达规律的认识。 二、RNA原位杂交中的探针 (一)探针的种类 RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。 1. 单链cDNA探针： 由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。 2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链 cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNARNA杂交体稳定。cRNARNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。 3. 寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与 mRNA形成的杂交体不如cRNARNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括 3H、 35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广泛。 (二)探针的标记 在 RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。 1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型 DNA或RNA的5端或3端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。 2. 体外转录法：体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在 RNA聚合酶的作用下，以 DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体 T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。 SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。 依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶 RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作有放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。 (三)探针的纯化 某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余 dNTP等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法的原理是： DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制 RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15% 的水，从而溶解一部分ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 (四)杂交前准备 1. 载玻片和盖玻片的处理 为有效防止外源性 RNA酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。将载玻片和盖玻片分别浸泡在 5 洁消精（苏洲吴县化工二厂）中12小时，用35-40 温水中冲洗30min，再用双蒸水漂洗3次，每次5min，室温下干燥切片后,在180 烤箱内烘烤46小时，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。 为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落，载玻片应涂以粘附剂，大的冰冻或石蜡切片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。 2. 明胶涂片制备 取 10克明胶（Merck）溶于1000毫升4050 双蒸水中，待明胶完全溶解后加入4毫升25% 硫酸铬钾溶液(chromium potassium sulfate CPS) ，使CPS的终浓度为0.1。将烘烤后的载玻片浸泡在明胶溶液中10min，在室温下干燥玻片。再将载玻片浸泡在含有1 多聚甲醛，PH7.4的PBS溶液中10min；在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有1 多聚甲醛，PH7.4的PBS中10min，在室温下干燥玻片。60 烤箱内过夜备用。 3. 多聚左旋赖氨酸涂片的制备 取 2-4mg多聚左旋赖氨酸(Sigma)，分子量在300000以上，溶于1ml消毒去离子水中。经旋涡器反复搅拌，吸取2030l滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用钻笔标出，室温下干燥切片后，在60烤箱内过夜备用。 4. 硅烷涂片的制备 取 5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane APES)(Sigma)溶于250ml丙酮内。将烘烤后的载玻片浸泡硅烷溶液中 60min，用双蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60 烤箱内过夜备用。 注意事项：载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脱落，不干扰杂交信号，低背景，经济及制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上的 RNA酶的污染。多聚左旋赖氨酸溶液的溶度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备载玻片应尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。 5. 新鲜标本的储存和冰冻切片制备 为 RNA原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防RNA酶的污染，制备过程中所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0.1% 焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate DEPC)水清洗。为防止RNA迅速降解，标本离体后，先切成1.51.2cm大小，其厚度不超过0.2cm，应迅速投入4 多聚甲醛溶液内，置4 冰箱内2 -4小时。再将组织移入30 蔗糖PBS溶液内，4 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80 或-140 超低温冰箱内保存。如作冰冻切片，先将组织在-20 恒冷切片机内停留,待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成7m薄片。40 烤箱内干燥切片2小时后储存在-80 或-140 超低温冰箱内备用。 6.标本的固定和石蜡切片的制备 石蜡切片作 RNA原位杂交的，也应严防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的过程同冰冻切片。为防止RNA迅速降解，离体后标本应立即有效固定。为保存良好组织结构，有利探针的穿透力，应选用合适的固定剂。常用的化学固定剂可分为，沉淀固定剂和交联固定剂两类。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入，但过长时间固定，可引起RNA降解。其不足之处是：组织形态结构的保持不如交联固定剂。交联固定剂能较好保存组织中RNA和组织形态结构，但固定时间过长，也可发生胞浆和胞核内大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。 4多聚甲醛固定液 取 4g多聚甲醛和0.25g甘氨酸分别溶于100ml 0.01mol/L PH7.0 PBS溶液，组织在常温下浸泡于4 多聚甲醛中4小时，每1小时将组织在真空下吸干10min，再注入新的固定液，共4次。然后用0.01mol/L PH7.0的PBS漂洗2次，每次30min。 福尔马林醋酸固定液 福尔马林醋酸固定液由 50 酒精、10 福尔马林和5 醋酸组成。在常温下将组织浸泡4小时，每 1小时在真空下吸干10分钟，再注入新的固定液，共4次，然后用50 酒精漂洗2次，每次30min。 (五)杂交前探针的选择 1. RNA探针: RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长 500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。 (1)孵育时间t = Lf- Lo / K Lo Lf (Lo核酸探针原长度(kb)，Lf核酸探针水解后所需长度 (kb)，K是常数率0.11kb/min)。 (2)在室温中加入下列试剂终止水解：3mol/L醋酸钠，6.6l(终浓度0.1mol/L)，醋酸1.3l(终浓度为0.5%)。 (3)加入下列试剂沉淀探针：7mol/L醋酸铵100l，100%乙醇 750l，RNA (10mg /ml) 2l ，置 -20 2 小时后恢复到室温，在1400rpm离心30min。 (4)小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddH2O稀释到10ng/l浓度。 (5)最终探针长度可于10% 聚丙稀酰胺凝胶在60 的尿素中电泳检测。 2. 探针的长度 原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记 cRNA探针的浓度为0.5ng/l，而非放射性标记 cRNA探针的浓度1.0ng/l 。杂交液的量要适当，每张切片以30-50l为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。 3.杂交的温度和时间 设置和调整杂交温度是 RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(meltingtemperature Tm)20-30。多数RNA原位杂交Tm为95，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1 甲酰胺浓度可降低0.72。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。一般 RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰胺的电离作用。 三、 cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交 (一)组织的前处理 1. 冰冻切片的制备：(1)离体后组织应切成1.51.2cm，厚度为0.2cm。(2)立即投入4 多聚甲醛溶液中（ PBS新配制），4 下固定2-4小时。(3)倒去固定液后，加入30 蔗糖溶液（ PBS新配制），4 下过夜, 次日将组织块储存在-80 或-140 超低温冰箱内。(4)或将组织块置于 -20 恒冷切片机内切成10m薄片，粘附于涂有粘附剂的载玻片上置室温下，置 40 恒温箱内过夜，或置40 恒温箱内至少2小时，后将切片放入切片盒在-80 超低温冰箱内存放备用。 2. 组织的固定和石蜡切片的制备：(1)离体后组织切成不大于1.5 1.2cm、厚0.2cm。(2)立即投入 4% 多聚甲醛溶液内(PBS新配制),或2.5 戊二醛，在室温下固定3-4小时。(3)用PBS冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。(4)切成5m薄片粘附于涂有粘附剂的载玻片上，在40 恒温箱内过夜干燥切片，用新的二甲苯脱蜡210min和100、95、70、各级酒精15min，ddH2O漂洗25min。 注意事项 (1)切除的新鲜标本应立即作组织固定或低温储存，以免mRNA降解。 (2)标本尽可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰冻切片，这一制备法既能避免mRNA降解，又能保持良好的组织形态。 (3)对外检病例中，采用10 福尔马林固定标本的，为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联(4)在冰冻切片和石蜡切片制作过程中，所使用的容器、器械都要经高压消毒，或清洁后用0.1% DEPC水清洗，再经ddH2O冲洗，避免外源性RNA酶污染。 (二)RNA探针的标记 RNA探针的制备需将cDNA探针克隆到带有RNA多聚酶启动子的质粒，然后转录制成RNA探针。用 EDTA缓冲液和DEPC处理的ddH2O将会影响RNA多聚酶中的质粒。RNA探针的长度应500bp，500bp的探针不易与mRNA形成杂交体。对探针标记、预杂交、杂交和后杂交流程中使用的容器、ddH2O均需经0.1% DEPC处理，为避免RNA酶污染，操作人员必须戴手套和口罩操作。 RNA探针的纯化：在杂交探针中加入5l 10 乙酸(acetic acicl)，11l 3mol/L醋酸纳 PH6.0，1l 10mg/ml tRNA，1.2l 1mol/L MgCl2，30