质粒DNA纯度的测定及其构型观察.ppt

实验二 质粒DNA纯度的测定及其构型观察 琼脂糖凝胶电泳法 实验目的 进一步区分质粒DNA中染色体DNA和RNA的污染 DNA的纯度 观察质粒DNA三种基本构象 可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度 实验原理 荧光物质Goldview在紫外光照射下能发出荧光 当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时 加入的Goldview就插入DNA分子中形成荧光络合物 使发射的荧光增强几十倍 荧光的强度正比于DNA含量 如将已知的标准样品做电泳对照 就可估计出待测样品的浓度 电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照 只需5 10ng的DNA 就可从照片上比较鉴别 实验原理 在一定电场强度下 DNA分子的迁移取决于分子筛效应 即DNA分子本身的大小和构型 相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样 因此 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA 也可以分离相对分子质量相同 构型不同的DNA分子 在凝胶电泳中 DNA分子的迁移速度与分子量的对数值呈反比关系 可以此特征区别染色体DNA 质粒DNA和RNA 若用小刀取下含质粒DNA的凝胶带经洗脱则可得纯DNA 用单一切点的酶消化后 与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照 观察其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小 实验原理 DNA分子在凝胶中泳动的速度还与DNA分子本身的构型有关 共价闭合环状DNA cccDNA 超螺旋结构泳动最快两条都断开的线状DNA LDNA 线性结构泳动速度居中 一条链断开的开环DNA ocDNA 复制中间体泳动最慢 因而可以通过电泳来区别质粒DNA的构型 实验方法 选择适当大小的电泳槽和点样梳 点样梳底部离电泳槽水平面的距离为1 2mm 制备琼脂糖凝胶 称取1 浓度的琼脂糖 加入TAE缓冲液 在微波炉上熔解 待凝胶冷却到50 左右时 加入Goldview混匀后 轻轻倒入电泳槽水平板上 除掉气泡 待凝胶冷却至凝固后 取出点样梳 在电泳槽内加入电泳缓冲液 使其正好漫过凝胶表面 在待测样品中加入6 loadingbuffer 混匀后小心地进行点样 每孔加样量视梳子的大小和胶的厚度而定 打开电源开关 最高电压不超过5V cm 即小电泳槽不得超过50V 当琼脂糖浓度低于0 5 时 电泳温度不能太高 电泳时间随实验具体要求而定 一般待DNA带分开后即可停止 当溴酚蓝泳动至2 3凝胶时可停止电泳 约需1小时左右 电泳结束后 小心取出凝胶 将凝胶放在紫外观察灯下观察电泳结果 质粒构型观察示意图 实验三 DNA的纯度 浓度的测定 紫外分光光度法 实验目的 从以上实验中提取到的质粒DNA 为了要作下一步的PCR或者酶切试验 必须测定DNA的纯度和浓度 实验原理 核酸具有吸收紫外光线的能力 在波长为260nm的条件下具吸收峰值 而蛋白质在280nm时具有吸收峰值 根据经验数据 纯核酸溶液OD260 1 8 2 0时 认为已达到所要求的纯度 当OD260 1时dsDNA dsRNA 50 g mlssDNA ssRNA 40 g ml核苷酸 20 g ml当RNAOD260 OD280 2 0纯品当DNAOD260 OD280 1 8 2 0纯品 2 0RNA污染 1 8pr污染 实验方法 DNA浓度和纯度鉴定 取石英杯一只 加入去离子水2500 l 放入751型分光光度计的比色槽中 使用氢灯 在260nm处调零 将水倒掉 换成2490 l水和10 lDNA溶液的混合液 按照同样的方法测出DNA样品在OD280的值 按公式算出所制备的DNA浓度及纯度 DNA浓度 g ml OD260值 稀释倍数 50 g ml L DNA纯度 OD260 OD280 要求比值在1 8 2 0范围内 实验方法 RNA的浓度测定和吸收光谱绘制 RNA的测定蒸馏水作为空白对照 在230nm 240nm 250nm 260nm