质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序.doc

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序；一、感受态细菌制备（CaCl2法）；1.从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种；2.取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50m；3.将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中；4.4条件下，4000r/min离心10分钟，；5.每管加入预冷的0.1mol/lCaCl2溶液；6.冰上放置10min后，4条件下质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37条件下振荡培养22.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.20.4左右（100l测600nm时OD值）。3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。转移到一个离心管中，共8ml。6. 冰上放置10min后，4条件下，4000r/min离心10min。7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。分装成200l的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70保存备用。二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。高压灭菌20分钟备用。2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4保存。另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4保存。3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。取出后，稍冷却，一个60mm的培养皿中加入约20ml培养基，无菌条件下铺板。5. 选择性培养基：培养基+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min，取出后放于60OC水浴，保持60oc温度加入100mg/ml的氨苄青霉素（Amp）即100ml LB加入100l Amp(Amp终浓度达到50g/ml），摇匀后铺板（20ml/板）上盖稍打开，37度烘箱/室温下放置干燥1-2天，封口膜包裹后贮4保存备用。三、质粒转化注意：取两管感受态细胞：为空白对照，不加质粒：加入质粒；每管加入量：体积10l，DNA50ng；质粒稀释成0.02g/l；200l感受态细胞中加入2l浓度为0.02g/l质粒。具体步骤：1. 取两管感受态细胞冰上放置解冻，同时质粒冰上解冻，开启水浴锅42oc管空白对照，不加质粒；管加入2l 0.02g/l的质粒，混匀，冰上放置30min2. 42水浴90s，不摇3. 取出，置冰上2min，加入LB 300l，37，200r/min振荡培养1小时，复苏细胞。同时将选择性培养基置于室温1小时。4. 取上述转化菌液150l涂布在相应的培养板上：不含Amp的培养板不含质粒菌液 含Amp的培养板a：不加质粒菌液；b：加质粒菌液 正面培养1h后，倒置培养过夜。5. 观察菌落生长情况，取含Amp培养板上加入含质粒菌液后生长的菌落，加入到5ml LB液体培养基中（加入Amp 5ul），37培养12h。6. 用含甘油30%的LB保存，-70 备用（甘油消毒、高压灭菌）。四、质粒提取1. 已转化好质粒的细菌加入到含有抗生素的LB培养液总共大概150ml在37恒温箱中摇菌过夜。2. 将细菌分装在4个50ml的离心管中，7000r/min，10分钟离心，倒掉上清。同时取10mlP1溶液加入10l的酶抑制剂，备用。3. 在每个离心管中加入1mlP1：酶抑制剂（1：1），吹打悬浮沉淀，然后将所有菌液集合到同一个离心管中。4. 加入5ml的P2溶液，轻柔的颠倒20次。放置4分钟。一旦加入P2，应立刻盖上盖子，以防酸化。Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿将溶解时间超过5分钟。5. 加入5ml的P3溶液，轻柔的颠倒20次。冰上孵育20分钟。加入P3后，会产生蓬松的白色物质，沉淀物变得不粘，沉淀物包括genomic DNA,Protein,细胞碎屑和SDS6. 13000r/min,30分钟离心，将上清倒至盖有一层纱布的吸附柱（Qiagen-tip100）中，吸附柱下放置一个装废液的饭盒。吸附柱使用前应用约4ml的QBT平衡，上清液应快速加入柱中，如果上清放置时间长则会变得混浊，系蛋白沉淀所致，须再次离心。7. 待滴完之后，加满QC液洗去残液，滴完后再重复一次。8. 用5mlQF液洗脱柱上的质粒至10ml离心管中。9. 加入3.5ml异丙醇，颠倒混匀，13000r/min，30分钟。可见沉淀物，小心弃去上清。10. 加入1ml70%的乙醇，溶解沉淀后转入1.5ml的appendorf管；再取1ml70%的乙醇，清洗管壁，转入1.5ml的appendorf管。11. 14600r/min，20分钟，弃上清，待乙醇蒸发后加入100lTE，再将两管集合（酌量，若质粒量比较多，可加入200l）。12. 取2l质粒液至加有98l双蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外分光光度计上检测质粒浓度和纯度。（纯度参照：1.82.0）13. 剩余的质粒标记日期，质粒种类，浓度放在-20冰箱保存，备用。五、细胞转染1.细胞计数后按一定数量植入24孔板中，放入培养箱中培养12小时，备用。2.根据转染的孔数及每孔