用固定化酶筛选模型从天然产物中筛选_葡萄糖苷酶抑制剂_卢大胜.pdf

实验研究 用固定化酶筛选模型从天然产物中筛选 葡萄糖苷酶抑制剂 卢大胜 吕敬慈 雍克岚 陈 旭 冯 顾慧娟 上海大学生命科学学院 上海 200436 摘要 目的 用固定化酶筛选模型从天然产物中筛选 葡萄糖苷酶抑制剂 方法 把 葡萄糖苷酶固定化 模拟其在体内小肠壁上的情况 建立固定化酶筛选模型 先用 葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖对该模型进行验证 然 后用该筛选模型对 2种天然产物 虎杖水溶性部位和广西血竭甲醇溶液进行筛选 结果 阿卡波糖对固定化 葡萄 糖苷酶和游离 葡萄糖苷酶的 IC50分别为 0 413 mg mL 1和 0 126 mg mL 1 虽然固定化酶被阿卡波糖抑制的 IC50 值是游离酶的 3 3倍 但固定化酶筛选模型更准确地反映阿卡波糖的体内作用 虎杖水溶性部位和广西血竭的甲 醇溶液对固定化 葡萄糖苷酶的 IC50分别为 0 224 mg mL 1和 5 5 g mL 1 结论 该筛选模型能很好的进行体外 葡萄糖苷酶抑制剂的筛选 其筛选结果和文献报道相符 关键词 固定化酶 葡萄糖苷酶抑制剂 天然产物 活性筛选 中图分类号 Q556 2 R285 5 文献标识码 A 文章编号 1003 3734 2005 12 1411 04 Screening for glucosidase inhibitors in natural medicines by immobilized enzyme LU Da sheng L Jing ci YONG Ke lan CHEN Xu FENG Si min GU Hui juan School of Life Sciences Shanghai University Shanghai 200436 China Abstract Objective To establish a screening model of immobilized enzymes for glucosidase inhibitors in vitro in natural medicines Methods Following after the immobilization of glucosidase in a mimic physical microenvironment as small intestinal membrane a screening model for glucosidase inhibitors was established The model was validated by means of a standard glucosidase inhibitor acarbose Subsequently the model was used to screen the glucosidase inhibitors from two natural medicines aqueous extracts of Polygonum cuspidatum and methanol extracts of Guangxi Dragon s blood Results Inhibition of acarbose to immobilized glucosidase was 3 3 times more potent than to free glucosidase IC500 413 versus 0 126 mg mL 1 which was coincident with the inhibition of acarbose in vivo The IC 50of Polygonum cuspidatum and Guangxi Dragon s blood against immobilized glucosidase was 0 224 mg mL 1 and 5 5 g mL 1 respectively Conclusion The model showed a potent capacity to screen glucosidase inhibitors invitro in natural medicines which was consistent with literatures outcomes Key words immobilized enzyme glucosidase inhibitor natural medicine screening 基金项目 上海市科技发展基金 02DZ9118 葡萄糖苷酶能催化 1 4 糖苷键水解 是小 肠内麦芽糖 蔗糖等寡糖水解酶 抑制 葡萄糖苷酶 的活性 可使葡萄糖的生成及吸收减缓 降低餐后血 糖峰值 调整血糖水平 从而减少高血糖对胰腺的刺 激 提高胰岛素敏感性 保护胰腺的功能 有效预防 糖尿病并改善并发症的发生和发展 1 2 因为碳水 化合物是脂肪生成的先导 3 所以 葡萄糖苷酶抑 制剂在调节糖代谢时也调节了脂肪的生成 4 另外 葡萄糖苷酶抑制剂还具有抗 HIV 等病毒感染的作 用 5 所以 葡萄糖苷酶抑制剂成为近年来药物化 学的研究热点 Hunziker 等 6 报道 葡萄糖苷酶在跨越双分子 1411 Chinese Journal of New Drugs 2005 Vol 14 No 12中国新药杂志 2005年第 14卷第 12期 层被多肽链锚定在膜上时 N 端在内 C 端在外 所 以 葡萄糖苷酶抑制剂的体内外药理学效果存在差 异 7 这也正是在体外有强活性的物质在体内不一 定有强活性的原因之一 但可以通过把 葡萄糖苷 酶的 N 端固定在载体上 模拟它在小肠壁上的情 况 这样可以更好地在体外研究它的抑制剂 评价抑 制剂的作用效果 排除了作用于 N 端抑制剂的假阳 性现象 本实验首先通过对 葡萄糖苷酶固定化做 成筛选模型 然后用具有代表性的 葡萄糖苷酶抑 制剂 阿卡波糖对该模型进行了验证 最后用此模型 对 2 种天然产物 虎杖水溶性部位和广西血竭进行 葡萄糖苷酶抑制剂的筛选 证实它们都有抑制 葡萄糖苷酶的效果 和文献报道 8 相符 材料与方法 1 药品与试剂 葡萄糖苷酶 Glucosidase EC3 2 1 20 购自 Sigma 公司 来源于酵母 广西血竭购自广西中医学 院 虎杖购自上海雷允上药业有限公司 4 硝基苯 D 吡喃葡萄糖苷 PNPG 购自 E merck 公司 还原型 谷胱甘肽 购自中国科学院上海生物化学研究所 壳聚糖 购自江苏日欣集团有限公司 四羟甲基氯 化磷 THPC 纯度 80 由浙江增新化学有限公司赠 送 二甲基亚砜和 25 戊二醛为分析纯 2 葡萄糖苷酶的固定化 2 1 壳聚糖的预处理 制备高脱乙酰度壳聚糖 取 20 g 壳聚糖 加入 350 mL 浓度为 40 NaOH 在 130 下搅拌反应时间 5 h 水洗至中性 105 干燥 粉粹 过 120 目筛 得预处理的壳聚糖 其脱乙酰度 为93 2 2 三羟甲基磷 THP 的制备 取等物质的量的 THPC 和KOH 分别溶于 90 mL 和 10 mL 水中 剧烈 搅拌下把 KOH 水溶液滴加到 THPC 水溶液中 滴加 完毕则反应结束 该反应液中 THP 的质量分数为 2 5 mg mL 1 整个反应在室温下进行 2 3 用 THP 作为交联剂固定 葡萄糖苷酶 待 THP 制备完毕 迅速向反应液中加入 70 mg 经预处 理过的壳聚糖 室温反应 8 min 过滤 水洗残留的 THP 然后用磷酸钾缓冲液 pH6 0 含有1mol L 1的 巯基乙醇和0 5 mol L 1的 EDTA 洗 最后加入 1 L 葡萄糖苷酶 0 1 U mL 1 在 5 下进行固定化 时 间为 2 h 待固定化完毕 用 5 mL pH6 8 的磷酸钾 缓冲液洗出未交联的 葡萄糖苷酶 然后在采用考 马斯亮蓝G 250法的监测下 进一步用 1 mol L 1 的 NaCl 水溶液洗尽未交联的酶 接着依次用水 pH6 8 的磷酸钾缓冲液洗 洗完后装入直径为 0 5 cm 长为 5 5 cm 的层析柱中 加入 pH6 8 的缓冲液 4 保存 3 模型的验证 把上述柱的缓冲溶液压到离柱顶下约 0 4 cm 后 分别加入 50 L PNPG 0 116 mol L 1 和一定量 的阿卡波糖 250 mg mL 1 轻轻摇晃一下使柱顶的 溶液混匀 然后继续压溶液至液面和柱顶相平 关上 柱底端的活塞 再把该柱放入水浴槽 37 反应 10 min 反应完毕 用 5 mL 的 pH6 8 缓冲液冲洗 收集 洗液 洗完毕后 把洗液稀释至 10 mL 用 UV 260 型 紫外分光光度计在 400 nm 处测定吸收度值 把上述 50 L PNPG 阿卡波糖溶液和 5 mL 缓冲液稀释至 10 mL 作空白 根据抑制率的定义与本实验的实际方法 按照 下式计算抑制率 抑制率 I AE A AE 100 AE为未加抑制剂时酶与底物反应后的吸收度 值 扣除相应空白 A 为加入抑制剂后酶反应的 吸收度值 扣除相应空白 对于每种抑制剂 以 lgC 为横坐标 抑制率 I 为纵坐标 做回归曲线 于 50 抑制率处得到 IC50 4 阿卡波糖对游离 葡萄糖苷酶作用的测定 先后将 pH6 8的磷酸钾缓冲液 1 mL 谷胱甘肽 1 mg mL 1 50 L 一定体积的阿卡波糖 葡萄糖 苷酶 1 L PNPG 0 116 mol L 1 50 L 加入试管混 匀 于 37 保温 10 min 后 加入 9 mL 碳酸钠 0 1 mol L 1 终止液 用上述同样的方法测定反应液的 吸收度值和计算阿卡波糖的抑制率 5 样品的制备和配置 取虎杖 10g 加入 95 乙醇100mL 浸泡 48 h 过 滤 滤液真空浓缩为浸膏 浸膏加入 100 mL 热水 80 搅拌 过滤 滤液真空浓缩为虎杖水溶性部 位浸膏 用蒸馏水配成 250 mg mL 1 的溶液待用 取广西血竭 100 mg 用甲醇配成 10 mg mL 1 的溶液 待用 6 固定化酶筛选模型从天然产物中筛选 葡萄糖 苷酶抑制剂 虎杖水溶性部位的筛选方法和 葡萄糖苷酶抑 制剂筛选模型的验证方法相同 广西血竭的筛选方 法除反应体系为甲醇 pH3 6 缓冲液 1 2 的混合液 外 其他相同 结 果 1 模型的建立及固定化 葡萄糖苷酶的理化性质 1412 Chinese Journal of New Drugs 2005 Vol 14 No 12中国新药杂志 2005年第 14卷第 12期 通过上述方法固定化的 葡萄糖苷酶活性的吸 收度值达到 0 229 活性回收率较高 为 41 2 固 定化所用的材料都是工业化常用试剂 这保证了筛 选模型成本很低 通过实验表明该固定化酶的耐酸碱能力有很大 增强 它在 pH4 0 条件下连续操作 4 h 活性基本没 变化 在有底物 PNPG 的Na2CO3溶液 0 1 mol L 1 pH 约 10 中水浴 37 10 min 它的活性仅减少 15 而游离的 葡萄糖苷酶马上失活 实验还发现 它耐有机溶剂能力很强 它能在甲醇 pH6 8 缓冲液 1 1 中正常地水解底物 PNPG 在甲醇 pH6 8 缓冲 液 1 2 中水解底物 PNPG 的能力比正常情况下高 58 5 由于天然产物的成分非常复杂 有的成分 是酸性 有的成分呈碱性 有的是水溶性的 有的是 醇溶性的 上述固定化酶的性质为筛选模型提供了 较广的天然产物筛选范围 实验表明固定化酶的热稳定性及贮存稳定性与 游离 葡萄糖苷酶相比有很大提高 这使该筛选模 型更适用和更方便 2 模型的验证 不同浓度的阿卡波糖对固定化或游离的 葡萄 糖苷酶的抑制作用比较见表 1 表 1 阿卡波糖对固定化或游离的 葡萄糖苷酶 的抑制率比较n 5 葡萄 糖苷酶 阿卡波糖 mg mL 1 00 050 1250 250 3750 50 625 IC50 mg mL 1 游 离028 7553 567 1768 2581 9283 420 126 固定化01037 1441 4345 715057 140 413 阿卡波糖对固定化 葡萄糖苷酶的 IC50为 0 413 mg mL 1 是其对游离 葡萄糖苷酶的 3 3 倍 0 126 mg mL 1 原因一方面是酶被固定化后 空 间在某种程度上受到了载体的限制 使它的底物不 能很好地与它接触发生作用 阿卡波糖是一种竞争 性抑制剂 同样是酶的底物 但它的量远小于底物 PNPG 所以它接触酶的机会要比 PNPG 少 则抑制能 力相应减少 另一方面是 葡萄糖苷酶被固定是模 拟它在小肠壁的情况 虽然底物具有作用 N 端的情 况 但由于 N 端被固定而使这种作用被阻拦 最终 影响了阿卡波糖对酶的抑制作用 可见该筛选模型 能成功模拟 葡萄糖苷酶在小肠壁上的情况 能较 准确在体外评价抑制剂的活性 从而可以避免体外 筛选出现作用于 N 端抑制剂的假阳性现象 提高筛 选的正确度和效率 验证实验完毕 用缓冲液冲洗 在不加抑制剂的 情况下测筛选模型柱的活性时 活性较验证实验前 约降低了 18 这可能是部分阿卡波糖仍保留在柱 上 未被缓冲液冲洗下来 从而影响了下一次的酶反 应 但这点降低不影响下一次的筛选 也就是说该筛 选模型是可以重复使用的 3 从天然产物中筛选 葡萄糖苷酶抑制剂 虎杖 水溶性部位对 葡萄糖苷酶的 IC50为 0 224 mg mL 1 广西血竭的IC50仅5 5 g mL 1 见 表 2 和 3 表 2 固定化酶筛选模型筛选虎杖水溶性部位 n 5 虎杖水溶性部位 mg mL 1 00 1250 250 3750 50 625 吸收度0 1110 0820 0510 0230 0180 019 抑制率 026 1354 0579 2883 7882 88 IC50 mg mL 10 224 表 3 固定化酶筛选模型筛选广西血竭的数据 n 5 广西血竭 mg mL 1 00 00250 0050 00750 010 01250 015 吸收度0 2480 1750 1410 1230 050 0620 019 抑制率 029 4443 1550 479 847592 34 IC50 g mL 15 5 对于醇溶性的天然产物 由于高浓度的醇会使 固定化酶失活 所以在筛选体系中选用醇和缓冲溶 液的混合溶液 该混合液一要保证不会使固定化酶 失活 二要能溶解样品 在筛选广西血竭实验中 选 用甲醇 pH3 6 缓冲液 1 2 的混合液 pH3 6 缓冲液 不但不影响酶的活性 而且增加广西血竭的溶解度 讨 论 本研究结果表明 该固定化酶抑制剂筛选模型 上的 葡萄糖苷酶比游离酶的耐受性 酸 碱 有机 溶剂 热 强 筛选天然产物的范围不再局限于游离 酶的较窄的筛选范围 中性 酸性 水溶性不能太 差 与游离酶相比较 固定化酶筛选模型上的酶由 于N 端被固定 其空间结构有所制约 从而使与底 物的结合受到一定程度的限制 导致其在实验中的 活力偏低 但这正是它模拟酶在小肠壁上的情况 所 以实验中反映出来的数据更接近于体内 另外 该固 定化酶筛选模型能重复再用 这样 该固定化酶筛选 模型适合高效 便利 快速地从众多的天然产物中筛 选到对 葡萄糖苷酶有抑制作用的天然抑制剂 该 固定化酶筛选模型除了筛选外 还可以直接在体外 评价 葡萄糖苷酶抑制剂的作用效果 研究一些已 知能够治疗糖尿病天然产物的作用机制 作者简介 卢大胜 1976 男 硕士研究生 通讯作者 雍克岚 1946 女 教授 主要从事生物活性 物质和新药的研究 联系电话 021 66132925 66134078 E mail klyong mail shu edu cn 1413 Chinese Journal of New Drugs 2005 Vol 14 No 12中国新药杂志 2005年第 14卷第 12期 参考文献 1 MoomdianAD ThurmanJE Drugtherapyofpostprandial hyperglycemia J Drugs 1999 57 1 19 29 2 Madar Z Omunsky Z Inhibition of intestinal glucosidase activity and postpradial hyperglycemia by glucosidase inhibitors in fa fa rats J Nutr Res 1991 11 9 1035 1046 3 Cianflone K Dahan S Monge JC et al Pathogenesis of carbohydrate induced hypertriglyceridemia using HepG2 cells as a model system J Arterioscler Thromb 1992 12 3 271 277 4 Baron AD Eckel RH Schmeiser L et al The effect of short term glucosidase inhibition on carbohydrate and lipid metabolism in type II noninsulin dependent diabetics J Metabolism 1987 36 5 409 415 5 Mehta A Zitzmann N Rudd PM et al Alpha Glucosidase inhibitors as potential broad based anti viral agents J FEBS Lett 1998 430 1 17 22 6 Hunziker W Spiess M Semenza G et al The sucrase isomaltase complex primary structure membrane orientation and evolution of a stalked intrinsic brush border protein J Cell 1986 46 2 227 234 7 Odaka H Miki N Ikeda H et al Effect of a disaccharidase inhibitor AO 128 on post prandial hyperglycemia in rats J J Jpn Soc Nutr Food Sci 1992 45 1 27 31 8 李英 沈忠明 葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化及其性质研究 J 天然产物研究与开发 2000 12 4 24 29 接受日期 2005 06 10 海星甾醇琥珀酸酯 A1998 脂肪乳静脉给药后 在大鼠体内的组织分布 张天宇 章国良 步秀云 王 昕 楼雅卿 北京大学基础医学院药理系 北京 100083 摘要 目的 研究海星甾醇琥珀酸酯 3 羟基雄甾 5 烯 17酮琥珀酸酯 A1998 脂肪乳经静脉给药后在大鼠 体内的组织分布经时变化规律 方法 大鼠单次静脉注射 20 mg kg 1A1998 脂肪乳后 分别于不同时间点剖取各组 织脏器 采用 HPLC 柱前衍生法测定大鼠各组织脏器药物含量 结果 A1998 在大鼠体内主要分布于肺 肝 脾等器 官 给药后 15 min 测得肺脏药物含量最高 32 73 3 87 g g 1 脾脏 23 47 8 04 g g 1及肝脏 14 87 1 63 g g 1次之 均远高于同时间点大鼠血药浓度 A1998 在上述 3 脏器中药物浓度维持时间亦久 至给药 36 h 后仍能 检测出较高浓度 分别为 4 37 2 74 4 69 2 37 及 8 30 5 96 g g 1 静注 A1998后心脏及肾脏中药物浓度 的经时变化与同时间点血药浓度相似 在胃 小肠 子宫 卵巢 体脂中未检测到药物分布 结论 大鼠单次静脉注 射 20mg kg 1A1998 脂肪乳后 药物在血浆中消除迅速 并快速分布于各组织 A1998 在大鼠体内的组织分布具有 较强的选择性 各组织中药物浓度经时变化结果提示对肺 肝 脾等脏器具有高度的亲和力 关键词 海星甾醇琥珀酸酯 3 羟基雄甾 5 烯 17 酮琥珀酸酯 A1998 大鼠 组织分布 HPLC 柱前衍生法 中图分类号 R969 1 R972 2 文献标识码 A 文章编号 1003 3734 2005 12 1414 04 Tissue distribution of 3 hydroxyandrost 5 en 17 one succinate A1998 intralipid after the intravenous inje