免疫标记在肿瘤中应用.doc

肿瘤病理诊断新技术一、 免疫组化技术 免疫组化技术现已广泛应用于病理诊断，不仅在解决疑难病例诊断方面起着重要作用，随着人们医疗风险意识的增强，许多普通的病例也常常需要免疫组化进一步证实，因此成为病理科医生常规工作中不可缺少的重要工作、常规手段。在小活检病理检查中免疫组化技术能明确地显示癌细胞的存在（如胃粘膜活检中的印戒细胞癌），可使微小癌、微小转移灶（淋巴结及骨髓）、甚至不易察觉的病变得以确诊。 通过乳腺癌激素受体（ER、PR）的检测，免疫组化技术在指导临床治疗方面已起到了重要的作用。通过检测针对肿瘤基因产物（C-erbB2、P53、ALK、CD117等）的抗体还将进一步为分子靶向治疗提供重要的参考依据。细胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫组化染色可为肿瘤的预后提供依据。免疫组化技术的局限性：至今无绝对特异的抗体！相当多的肿瘤缺乏特异的抗原表达；同一种抗原常常可在多种肿瘤中表达，不少肿瘤又由于分化太差或细胞分子结构改变而不表达相关的抗原。不同抗体滴度有不同的阳性结果；内源性生物素造成假阳性，如肝细胞癌等；缺乏免疫组化的标准化（同一实验室及不同实验室间结果的一致性）；定量结果的判断等还存在不少的问题尚待解决，如ER受体，有的实验室只要有阳性肿瘤细胞就视为阳性，而有的实验室则要至少20细胞阳性才视为阳性，阳性标准往往是随意确定的，未经临床病理研究证实。如何正确应用免疫组化呢? 要得到正确、有价值的免疫组化结果，免疫组化实验室规范、合适的技术操作（包括组织固定、抗原修复、检测系统、各类试剂的质量保证、染色技术等）是最重要的基础保证，但病理科医生在组织块的选择、抗体的选择、结果的判断等方面也起着不容忽视的作用。 二 分子病理学 这是继电镜、免疫组化之后的第三个浪潮。其优点是反应特异、敏感，检测靶信号本质上不同，DNA检测温度固定影响小。采用的方法包括PCR、滤膜杂交（斑点、印迹转移），原位杂交、荧光原位杂交（FISH）、显微切割技术、比较基因组杂交、生物芯片（基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片）等。分子病理学检测内容包括肿瘤基因(癌基因、抑癌基因/原癌基因)、点突变、染色体重排（易位、倒转过表达/新的杂合基因）、基因扩增和缺失等。分子病理学检测为肿瘤定性、分类、预后判断可起到重要的帮助。显微切割技术是90年代出现的一项新技术，这项技术对肿瘤、细胞生物学及分子生物学研究有巨大的推动作用。该技术能够在显微镜下，从组织切片上切下小片组织或单个细胞，用这些切下的材料进行PCR扩增，能够得到同类细胞，甚至单个细胞的基因，这样研究结果更为准确。 组织芯片又称组织微阵列（tissue microarray）, 是1998年在cDNA微阵列的基础上发明的一种特殊的生物芯片，是继基因芯片和蛋白芯片之后生物芯片家族的又一新成员。组织芯片的原理是根据不同需要，利用特殊的仪器，将多个（病例）小组织片高密度的、整齐的排列固定在某一固相载体上（载玻片、硅片、聚丙烯或尼龙膜等），而制成微缩的组织切片。其最大潜在作用是将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合，使应用同一实验指标，同时快速研究大量不同组织样本（高通量、多样本）的设想成为现实，减少了实验误差，几十倍、上百倍的提高组织病理学研究的效率，节约实验材料和试剂，同时使实验结果有更可靠的可比性；对于原始病理资料的保存和大量样本的回顾性研究具重要的意义。 组织芯片的应用范围：研究目的基因在不同病变（肿瘤）间的表达差异；寻找疾病新基因，疾病（肿瘤）中新基因、突变体与基因多态性的检测，药物的筛选；疾病的病理诊断；质量控制等。 原位杂交是在一定的生物结构基础之上的核酸杂交，这种结构基础可以是一条染色体、一个细菌、更大的结构基础是细胞和组织。故此杂交的共同点是有明确的结构基础，可反映基因杂交的准确部位。 免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的应用 一、免疫组织化学的工作原理 1、 已知的特异性抗体或抗原能特异性结合 2、 通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金 属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 3、 借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构二、应用范围： (1)提高病理诊断准确性 (2)对疾病的预后和治疗的意义 (3)对肿瘤增生程度的评价 (4)微小病灶的发现 微小癌，微小病灶（如羊水栓塞） (5)指导肿瘤的治疗 (6)恶性淋巴瘤及白血病的诊断及分型(7)病原微生物的检测三、常用的肿瘤标记1上皮性肿瘤标记物(1)共同的标记物角蛋白*(cytokeratin/keratin, CK/KER)*共有20种亚型，高分子量角蛋白见于复层鳞状上皮，低分子量角蛋白见于腺上皮。桥粒蛋白*(desmoplankin)*分布于上皮细胞间的连接部位，是一种很好的上皮细胞标记，此外，凡有细胞连接的非上皮细胞也可以表达，如脑膜瘤、尤文肉瘤、颗粒细胞瘤、精原细胞瘤。(2)存在于大部分上皮细胞内的标记物上皮膜抗原(epithelial membranous antigen, EMA)*大多数上皮性肿瘤，常与角蛋白联合应用*腺上皮性肿瘤，浆细胞瘤，大细胞淋巴瘤，浆细胞骨髓瘤，脑膜瘤均有表达。 (3)选择性存在于某些上皮细胞内的标记物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)*是内胚层来源的上皮性肿瘤分化标记物，见于腺癌及某些鳞癌，鉴别腺癌(+)与间皮瘤(-)。但血细胞来源的肿瘤(绿色瘤、髓细胞白血病)、恶性纤维组织细胞瘤均呈阳性反应。甲胎蛋白(-fetoprotein,AFP) 肝细胞癌，生殖细胞性肿瘤，如内胚窦瘤，睾丸胚胎癌有交叉反应。前列腺特异性抗原(prostatic specific antigen，PSA) 前列腺上皮及其来源的肿瘤，也可从转移性肿瘤中鉴别出前列腺癌结肠癌相关抗原(CA19-9) 胃肠道肿瘤，胰腺癌卵巢癌抗原(CA125) 卵巢、子宫、乳腺癌2间叶源性肿瘤标记物(1)间叶细胞及肿瘤共同标记物波形蛋白*(vimentin, VIM) 间叶组织、良、恶性肿瘤*缺乏特异性，配合其他更有鉴别力的标记物仍有价值。(2)肌细胞，肌上皮及肿瘤标记物结蛋白(desmin，DM) 肌细胞及其肿瘤(横纹肌肉瘤/平滑肌肉瘤)肌红蛋白(myoglobin，MG) 横纹肌，心肌细胞及其肿瘤肌球蛋白(myosin) 横纹肌特异性标记物，但不敏感肌肉特异性肌动蛋白(ms-actin,MSA,CMA,HHF35) 平滑肌，横纹肌、肌上皮，肌纤维母细胞平滑肌肌动蛋白(SM-actin/SMA) 对平滑肌较特异(3)内皮细胞及肿瘤标记物第因子相关抗原(factor -related antigen, FRAg) 血管内皮细胞及其肿瘤CD31 血管肉瘤 上皮样血管内皮瘤特异性较强CD34 内皮细胞，血管良恶性肿瘤，kapposi肉瘤*胃肠道间质肿瘤70%病例为CD34阳性 *100%病例CD117阳性(4)组织细胞标记物CD68(Kp-1) 全组织细胞标记物，如恶性纤维组织细胞瘤 无明确特异性-抗糜蛋白酶(-antichymotrypsin AACT) 具有组织细胞分化的肿瘤，如恶纤组-抗胰蛋白酶(-antitrypsin,AAT)* 组织细胞及其肿瘤*肝细胞癌，具有肝细胞癌分化的生殖细胞肿瘤，如内胚窦瘤，亦标记胶质细胞瘤溶菌酶(lysazyme，lys) 组织细胞及其肿瘤，其特异性不如AAT3. 淋巴造血组织标记物(1) 共同标记物白细胞共同抗原(leukocyte common antigen, LCA)CD45全白细胞标记，血白细胞，单核细胞，肥大细胞，各种淋巴瘤；浆细胞及R-S细胞，不表达LCA(2) T淋巴细胞标记物CD45RO(UCHL-1)、CD3、CD43 (L60/Leu-27) T细胞淋巴瘤(3) B淋巴细胞标记物CD20(L26)、CDW75(LN1)、CD19 B细胞淋巴瘤(4) 霍奇金R-S细胞标记物CD15+(Leu-M1)、CD30*(BerH2)+ 霍奇金淋巴瘤(非淋巴细胞为主型)CD20+、CDW75+、CD30-/+、CD15- EMA+ 霍奇金淋巴瘤(淋巴细胞为主型)*CD30粒细胞、单核细胞、上皮细胞、R-S细胞均有表达，某些未分化大细胞淋巴瘤(+)(5)组织细胞原性淋巴瘤标记物CD68、MAC387、AAT、AACT +*CD意为分化群(cluster of differentiation, CD)，是白细胞相关抗原的国际分类系统，现已规定了147种白细胞抗原，由此也有相应抗体的命名。4. 神经源性肿瘤标记物(1)胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillory acidic protein, GFAP)星形细胞瘤，各种胶质瘤，室管膜瘤，可与脑膜瘤鉴别(2)少突细胞与雪旺细胞标记物髓鞘碱性蛋白(MBP) 神经鞘瘤S-100蛋白* 神经鞘瘤，少突胶质细胞瘤，星形细胞瘤, 副节瘤*S-100还对黑痣、黑色素瘤、软骨性肿瘤、脂肪肿瘤呈阳性反应(3)神经细胞及神经内分泌细胞标记神经微丝(neurofilament, NF) 神经细胞及其肿瘤，如神经母细胞瘤、嗜铬细胞瘤神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)*嗜铬粒(chromograninA,ChrA)突触素(synaptophysin,syn)NSE是神经内分泌肿瘤首选的标记物，而NSE、chr、syn三者均是APUDoma标记物，见于嗜铬细胞瘤，副节瘤、PNET/尤文肉瘤、类癌、Merkel细胞瘤、甲状腺髓样癌、肺小细胞癌等。NSE还与某些乳腺癌、大细胞淋巴瘤呈阳性反应。(4)黑色素细胞标记物人类黑色素瘤抗体HMB45 S-100蛋白黑色素瘤和透明细胞肉瘤呈阳性反应，HMB45特异性强，但不及S-100敏感。5内分泌肿瘤标记物垂体激素 垂体细胞及其肿瘤，分泌性APUD肿瘤(“异位”激素)促肾上腺皮质激素(ACTH)、生长激素(GH)、泌乳素(LH)、促甲状腺激素(TSH)甲状腺球蛋白(TGB) 甲状腺上皮肿瘤降钙素(CT) 甲状腺髓样癌及C细胞增生胰岛细胞相关激素及胃肠道激素 胰岛细胞瘤、胃肠道神经内分泌肿瘤胰岛素(insulin)、胃泌素(gastrin)、生长抑素(somatostatin)、高血糖素(glucogen)、胰多肽(pancreatic peptide)、蛙皮素(bombsin)、小肠血管活性多肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)、P物质血清素(seratonin) APUD肿瘤睾丸酮 睾丸及卵巢性索间质肿瘤人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、人类胎盘泌乳素(hPL)： 滋养细胞肿瘤及具有滋养叶成分的生殖细胞源性肿瘤6细胞外基质标记物胶原蛋白(collagen)型胶原 骨肉瘤型胶原 软骨肉瘤型胶原 纤维肉瘤型胶原 基底膜特异性抗原，血管源性肿瘤型胶原 广泛存在于全身层粘蛋白(laminin, LN) 为基底膜连接蛋白，用于肿瘤浸润及转移机制研究纤维连接蛋白(fibronectin FN) 作为间质肿瘤标记物，也用于肿瘤浸润转移研究七、癌基因标记物主要癌基因，其活化方式和相关人类肿瘤四、举例说明（一）、肉瘤：Vimentin+ Cytokeratin- LCA-1、恶黑：HMB45+，S-100+，Melon-A+，2、肌源性肉瘤：HHF35（Actin）+，Desmin+3、平滑肌肉瘤：Actin(sm)+4、横纹肌肉瘤：Myoglobin+，Myosin+，MyD1+5、恶纤组：CD68+，Lysozyme+6、滑膜肉瘤：Cytokeratin+7、恶性间皮瘤：Calretinin+，Mesotheliol cell+8、原始神经外胚瘤：CD99+，Neuroblestoma+9、恶性神经鞘瘤，脂肪肉瘤：S-100+10、血管肉瘤：F8+，CD34+，CD31+（二）、淋巴瘤：LCA+，Vinentin，Cytokeratin-1、CD20（B细胞）、CD3（T细胞）、LCA为一线抗体；2、有大的异型肿瘤细胞时有大异型淋巴细胞时加CD30+（何杰金细胞或间变大细胞淋巴瘤）、ALK+（间变大细胞淋巴瘤）；有大异型上皮样细胞巢时，加CK+（癌）、HMB45+（恶黑）；伯基特淋巴瘤，Ki67 100%阳性。3、有浆样分化浆细胞肉瘤（CD20-，CD3-阴性）：用、链只有其中一种阳性；CD20阳性，有浆样分化，诊断为浆样分化B细胞淋巴瘤。 4、主要是中小异型淋巴细胞套区淋巴瘤：CD5+，Cyclin D1+，CD10-；滤泡性淋巴瘤与反应性滤泡鉴别：Bcl-2+为滤泡性淋巴瘤（CD10+）；淋巴母细胞淋巴瘤（CD20及CD3均阴性）：TdT+（2份免疫组化价格）；滤泡中心细胞淋巴瘤:：CD10+；粒细胞肉瘤，MPO+或溶菌酶+；B细胞慢性淋巴细胞白血病：CD23+5、其他大且不规则的细胞核NK细胞淋巴瘤，Dako公司产品CD56+；迈新公司产品CD57+；组织细胞：CD68+；证实Langerhans细胞用S-100；证实滤泡树突状细胞用CD35；6、考虑“传单”用EBV；（三）、癌：Cytokeratin+，Vinentin-，LCA-1、神经内分泌癌：C