特发膜肾病分子发病机制研究.doc

特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是成人肾病综合征中常见类型之一。在我国，其发病率在原发性肾小球疾病中位于第三位，仅次于IgA肾病和系膜增生性肾炎。临床实践证明，膜性肾病是一个不均一的群体，其自然病程显示，1/3患者可自发缓解，1/3患者持续蛋白尿，但肾功能稳定，1/3患者肾功能进行性减退。但是目前临床上并没有一些公认的指标可以预测膜性肾病的预后和转归;膜性肾病仍然是临床上一类难治的疾病，并且由于对膜性肾病的发病机制认识不清，因而在选择治疗方案上往往以经验为主，缺乏理论基础指导，这也是造成膜性肾病难治的因素之一。 特发性膜性肾病最主要的特征为上皮侧免疫复合物形成。多种机制可参与该免疫复合物的形成，包括：带正电荷的外源性抗原种植在上皮下，致原位免疫复合物形成；低亲和力的抗体如IgG4形成的循环免疫复合物在内皮侧解聚，穿过基底膜在上皮侧再次聚合；上皮细胞表面抗原成份致原位免疫复合物形成等。因此不同机制引起的免疫复合物的沉积构象可能不同。 在膜性肾病的发病过程中，C5b9占有主要地位，C5b9在上皮侧形成后，作用于足细胞，可引起足细胞发生一系列变化；C5b9的形成不仅是补体活化的后果，而且还受补体调节蛋白的调控；特发性膜性肾病与狼疮性肾炎膜性病变不同，其肾组织以IgG4沉积为主，IgG4通过旁路途径激活补体，其免疫机制有别于继发性膜性肾病。因此这些分子在特发性膜性肾病是如何分布的，分子之间有何联系，与免疫复合物空间构象间以及临床的关系如何，目前缺乏这方面详细的研究资料。 为了突破单纯依靠组织形态学诊断膜性肾病的局限，本研究从分子病理学出发，根据IMN最具特征性的形态学特点上皮侧免疫复合物形成，对不同IMN患者上皮侧免疫复合物IgG/肾小球基底膜(GBM)的三维空间构象结合超微结构进行了观察，以揭示IMN分子病理形态学上的不均一性：并在此基础上，从不同角度观察多种致病因子包括膜攻击复合物C5b9、IgG亚型、足细胞病变及趋化因子受体在膜性肾病中的分布，以探讨其内在联系及揭示膜性肾病分子发病机制的特殊性，为临床进行“分型诊断、个体化治疗”提供理论基础。 本论文分二部分 第一部分 特发性膜性肾病患者肾小球免疫复合物特征的研究 研究一 肾小球免疫复合物空间构象的分析 目的：对特发性膜性肾病患者肾小球上皮侧免疫复合物的构型进行观察，揭示其分子病理形态学上的不均一。 方法：87例经肾穿刺活检及临床诊断为特发性膜性肾病患者肾组织，为了观察免疫复合物与基底膜的关系，运用免疫荧光双套色法，在激光共聚焦显微镜下观察上皮侧免疫复合物沉积构象特征。 结果：87例患者在共聚焦显微镜下可分为两类：基底膜增生反应型及非增生反应型，分别为41例和46例。基底膜增生反应型表现为基底膜显著增厚，IgG呈密集颗粒状嵌入基底膜中，部分区域IgG与基底膜融合：非增生反应型表现为基底膜增厚不明显，IgG绝大部分区域呈线性或双轨状分布。 结论：特发性膜性肾病上皮侧免疫复合物的沉积呈现不同的空间构象特点。进一步探索上述分子病理形态学上不均一性产生的本质，将有助于提高对膜性肾病发病机理的认识。 研究二 肾小球免疫复合物空间构象与其超微结构的关系 目的：利用电镜观察特发性膜性肾病患者肾小球上皮侧电子致密物的沉积特点及其与免疫复合物空间构象之间的联系：分析免疫复合物空间构象与疾病分期的关系，以期明确免疫复合物空间构象特征与疾病病程之间是否存在内在关联。 方法：在双盲的情况下，运用透射电镜对48例特发性膜性肾病患者肾小球基底膜超微结构进行观察，突出其电子致密物的沉积特点和膜性肾病病理分期。 结果：1)在电镜下，特发性膜性肾病患者上皮侧电子致密物的分布存在差异，大致可以分为两组，一组为异质型，表现为电子致密物大小不规则，分布不 均一：另一组为均一型，表现为电子致密物大小较规则，分布尚均一。与免疫复合物空间构象比较，增生反应型患者其电镜下以异质型为主，而非增生反应型患者，电镜下以均一型为主。免疫复合物空间构象与电子致密物的分布形式存在相关性(r=0.641)。2)增生反应型组患者病理分期以、期为主，非增生反应型组患者以期为主。但两组患者在、期分布上无显著差异。 结论：电镜的结果进一步证实特发性膜性肾病患者免疫复合物空间构象与上皮下免疫复合物的大小、分布有密切的联系，而与疾病分期之间似无显著的相关性。 研究三 肾小球免疫复合物空间构象与临床表现的关系 目的：分析特发性膜性肾病患者肾小球免疫复合物空间构象与病人临床表现之间的联系。 方法：收集87例患者临床资料，分析免疫复合物空间构象与临床表现之间的联系。 结果：表现为基底膜增生反应型和基底膜非增生反应型的两组患者，在其蛋白尿程度，血清肌酐水平上均无明显差异。 结论：通过临床表现的分析结合病理分期，显示免疫复合物空间构象的差异并不完全是由于病程阶段不同造成的。因此这种分子病理形态学上的不同，可能提示了其潜在分子发病机制的不同；进一步从分子发病机制上揭示免疫复合物空间构象的形成机制，将有助于提高对膜性肾病的认识。 第二部分 特发性膜性肾病分子病因学研究 研究一 肾小球补体膜攻击复合物(C5b9)沉积与免疫复合物空间构象的关系 目的：观察C5b9在特发性膜性肾病中的分布特点及其与免疫复合物空间构象间的关系。 方法：C5b9染色采用间接免疫荧光方法；并利用WT1染色观察足细胞变化。 结果：87例患者中，有58例患者肾组织存在程度不等的C5b9沉积，29例患者肾组织内未检测到C5b9沉积。不同免疫复合物空间构象，C5b9沉积阳性率不同，在基底膜增生反应型明显高于基底膜非增生反应型。足细胞标记物WT1 染色显示，WT1阳性细胞分布面积在C5b9阳性组明显减少。临床资料显示，初次肾活检时，两组患者在临床表现上包括尿蛋白、血清白蛋白、血脂及肾功能方面无明显差异。 结论：基底膜增生反应型与非增生反应型患者肾组织C5b9的沉积存在差异，后者肾组织C5b9沉积明显低于前者。该现象提示C5b9可能不是特发性膜性肾病唯一致病途径。 研究二 肾小球补体调节蛋白表达与C5b9沉积的关系 目的：为了进一步研究为何部分膜性肾病患者肾小球中无C5b9沉积，观察补体调节蛋白的分布特点及其与C5b9沉积的关系。 方法：选择C5b9阳性患者15例，阴性患者13例，利用免疫组化方法观察补体调节蛋白CR1及CD59分子在肾组织中的分布。并选择6例供肾作为正常对照。 结果：在正常肾组织，CR1沿毛细血管袢弥漫分布，CD59分布在肾小球基底膜内外侧，其表达强度较CR1弱。在特发性膜性肾病，在15例C5b9沉积阳性的患者中有11例出现CR1节段表达缺失，在这些患者中CD59染色强度增强；在13例C5b9沉积阴性患者中仅3例出现CR1节段表达缺失；CD59表达增强者也只有2例。 结论：补体调节蛋白CR1与CD59分子在C5b9沉积阳性与阴性患者中的分布与表达有所不同。这种差异是否是造成膜性肾病患者肾组织C5b9沉积不同的原因有待进一步论证。 研究三 肾小球IgG亚型分布与E5b9沉积的关系 目的：观察IgG亚型在特发性膜性肾病患者肾小球中的分布特点，探讨其与C5b9沉积的关系 方法：利用免疫组化方法观察肾组织中IgG亚型的分布：ELISA方法检测血清中IgG亚型的分布。 结果：1)肾组织IgG亚型以IgG4沉积为主。IgG1在大部分患者沉积不强，IgG4在56.5患者表现为强阳性(+)，35.3患者表现为阳性(+)，8.2表现为阴性。并且IgG4在C5b9阳性患者强度明显增强。血清中IgG亚型除IgG1及IgG2水平降低外，IgG3及IgG4与正常对照无明显差别，血清中IgG4水平与肾组织IgG4沉积间亦无相关性：2)IgG4+组与IgG4+组相比，除血清肌酐较高外，尿蛋白程度、血清白蛋白以及血脂在两组间皆无明显差异。 结论：IgG亚型尤其是IgG4在肾组织中的沉积也存在不均一性，肾小球C5b-9阳性患者IgG4沉积强度明显增加。 研究四 肾小球趋化因子受体分布与C5b-9沉积的关系 目的：观察趋化因子受体在特发性膜性肾病中的分布特点及其与C5b9沉积的关系。 方法：选择C5b9阳性组及阴性组患者各23例及20例，免疫荧光方法观察趋化因子受体CXCR1及CXCR5在肾组织中的分布。 结果：正常肾组织可见CXCR1及CXCR5沿肾小球毛细血管袢散在分布；在特发性膜性肾病患者，CXCR1及CXCR5在大部分患者呈现弥漫分布