香菇母种液体培养.doc

宜宾职业技术学院宜宾职业技术学院 毕业论文 香菇母种液体培养香菇母种液体培养试验试验 系系 部部 生物与化工工程系生物与化工工程系 专专 业业 名名 称称 生物技术及应用生物技术及应用 班班 级级 生生 物物 10911091 姓姓 名名 汤汤 琳琳 琳琳 学学 号号 200911539200911539 指指 导导 教教 师师 张张 敬敬 慧慧 20112011 年年 5 5 月月 8 8 日日 Comment u1 试验结果表明在同等 条件下 Comment u2 可不用 1 香菇母种液体培养试验香菇母种液体培养试验 指导教师 张敬慧 2009 级生物技术与运用专业 学号 200911539 姓名 汤琳琳 摘摘 要要 本次试验采用未开幕的新鲜香菇的子实体和孢子为试验材料 把孢子稀释 液和无菌子实体块分别接种到相同的马铃薯液体培养基中 置于相同转速的摇 床上培养 记录菌丝萌发时间 菌丝长满培养基的时间 菌丝浓度 比浊法 菌丝粗细度来综合分析菌种质量 试验结果表明 用孢子来制种 比子实体制种更为理想 用液体摇床法制种污染率低 制种时间短 吃料能力强 菌丝优质还对 菌株有一定的复壮作用 减轻了传统制种中污染率大 产量低 制种时间长 等问题 关键词关键词 香菇 母种 液体 摇床 2 Mushrooms Mother Kind Of Liquid Culture Tutor ZhangJingHui Author TangLinLin Abstract The experiment the opening of fresh mushrooms not the fruit body and spores for test materials The spores and no JunZi entity dilutions of vaccination to the same potatoes are liquid medium At the same speed wave bed training record time with hyphae germination hyphae of media concentration time hyphae than turbidity method hyphae degrees strains comprehensive analysis of the degree of quality Test results indicate that using the spores to breeding than a more ideal cafa system To use liquid wave bed legal kind of pollution rate is low kind of short time eat material capability high quality of strains hyphae has certain rejuvenation and reduce the role of traditional breeding rate of pollution and low yield potential big time Keywords mushrooms Mother species Liquid Wave be Comment u3 本文不是论文而是一 篇综述了 仔细看看论文指导书试验 性论文的书写方法 3 目目 录录 摘摘 要要 1 ABSTRACT 2 目目 录录 3 前前 言言 4 1 香菇制种的选材香菇制种的选材 5 1 1 子实体 5 1 2 孢子的提取 6 2 2 香菇母种液体培养方法香菇母种液体培养方法 6 2 1 香菇母种液体培养的主要原理 6 2 2 常用的香菇母种培养的方法及其作用 6 2 2 1 根据营养物质的成分分类 6 2 2 2 根据培养基的状态分类 7 3 传统固体制种培养基的特点传统固体制种培养基的特点 8 3 1 优点 8 3 2 缺点 8 4 液体培养基的配方液体培养基的配方 8 4 1 此次试验液体培养基的配方 8 4 2 液体培养基的可行性 9 5 试验操作试验操作 9 5 1 培养基的制作 9 5 2 接种 9 5 3 调节适应生长环境 11 5 4 注意事项 11 6 结果分析结果分析 11 7 结论结论 12 致谢致谢 12 参考文献参考文献 12 Comment u4 注意格式 4 前前 言言 香菇 mushrooms 是世界第二大食用菌 也是我国特产之一 在民间素 有 山珍 之称 香菇富含维生素 B 群 铁 钾 维生素 D 原 经日晒后转成 维生素 D 味甘 性平 主治食欲减退 少气乏力 香菇属于真菌界 伞菌目 口蘑科 香菇属 香菇栽培始源于中国 至今 已有 800 年以上的历史 香菇的砍花栽培源于中国 现行的段木纯菌丝接种 栽培则源于日本 至 1989 年 我国香菇总产首次超过日本 一跃成为世界 香菇生产第一大国 1 香菇子实体 Mushrooms fruit body 单生 丛生或群生 菌盖直径 5 12cm 有时可达 20cm 幼时半球形 后呈扁平至稍扁平 表面菱色 浅褐色 深褐色至深肉桂色 中部往往有深色鳞片 而边缘常有污白色毛状或絮状鳞片 菌肉白色 稍厚或厚 细密 具香味 菌盖下面有菌幕 后破裂 形成不完整 的菌环 菌褶白色 密 弯生 不等长 菌柄常偏生 白色 弯曲 长 3 8cm 粗 0 5 1 5 2 cm 菌环易消失 白色 孢子印 Spore seal 白色 孢子光滑 无色 椭圆形至卵圆形 4 5 7 3 4 m 用孢子生殖 生态环境 冬春季生于 阔叶树倒木上 群生 散生或单生 分布地区 山东 河南 浙江 福建 台湾 广东 广西 安徽 湖 南 湖北 江西 四川 贵州 云南 陕西 甘肃 香菇是具有高蛋白 低脂肪 多糖 多种氨基酸和多种维生素的菌类食 物 2 1 提高机体免疫功能 香菇多糖可提高 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能 还可促进 T 淋巴细胞的产生 并提高 T 淋巴细胞的杀伤活性 2 延缓衰老 香菇的水提取物对过氧化氢有清除作用 对体内的过氧 化氢有一定的消除作用 3 防癌抗癌 香菇菌盖部分含有双链结构的核糖核酸 进入人体后 会产生具有抗癌作用的干扰素 5 4 降血压 降血脂 降胆固醇 香菇中含有 嘌呤 胆碱 酪氨酸 氧 化酶以及某些核酸物质 能起到降血压 降胆固醇 降血脂的作用 又可预 防动脉硬化 肝硬化等疾病 5 香菇还对糖尿病 肺结核 传染性肝炎 神经炎等起治疗作用 又可用于消化不良 便秘等 3 1964 年中国开始进行人工栽培食用菌 1979 年开始使用木屑袋栽技术 1990 年使用野草栽培技术 先如今不断完善 开始使用液体栽培技术 4 香菇母种传统的制种工艺将母种直接接入原种培养基中 经多年制种实 践 总结出将母种先接入液体培养基 采用液体浅层培养技术 再将菌丝体 接入原种培养基中 用此方法制种成功率高 而且发菌快 吃料能力强 菌 丝粗壮 浓白 5 更重要的是还对菌株有一定的复壮作用 它适用于大多数 食用菌菌种的制作 减轻了传统制种中污染率大 产量低 制种时间长等问 题 6 此次实验用马铃薯液体培养基 Potato liquid medium 对香菇的孢子和子 实体在特定条件下的摇床中进行培养 用实验结果 培养基的澄清度 菌球形态 菌 丝球个数 菌体干重等 7 证明孢子或子实体培养的那一方法更利于高效培养 香菇母种 结合实验数据作出对比 得出结论 1 香菇香菇制种的选材制种的选材 在晴天下午采摘已成熟还未开幕的长势良好的香菇 如果没有次类条件的 可在市场或超市购买 但必须较为新鲜 菌体较为完整 七八成熟 菌幕还未 打开 这样更利于对孢子的收集 1 1 子实体子实体 取新鲜香菇 清洗干净 切取菌柄 在无菌操作台中 用 75 的酒精对子 实体表面进行消毒灭菌处理 放入无菌操作盘中 用无菌刀从中部剖开 从里 部切取长 2mm 的立方体若干 装入小烧杯中待用 让烧杯处于无菌环境中 且 不能放置太久 6 1 2 孢子的提取孢子的提取 2 2 1 将新鲜的子实体用刀片齐菌褶把菌柄切断 然后把菌盖扣在白纸 上 有色孢子 或黑纸上 白色孢子 也可把一半白纸和一半黑纸拼粘成一张 纸而将菌盖扣于上面 再用玻璃罩扣上 经过2 至 4 小时 担孢子就散落 在纸上 从而得到了 l 张与菌褶或菌管排列方式相同的孢子印 2 2 2 将用来接收孢子的纸折迭起来 在中央剪出一个适合的圆孔 再把 菌柄插入洞内 使菌褶紧贴纸上 然后再将子实体连同纸一起放在盛有半杯水 的小杯口上 此法可加速孢子印的接收 2 2 香菇母种液体培养香菇母种液体培养方法方法 2 12 1 香菇母种液体培养的香菇母种液体培养的主要原理主要原理 在发酵罐或三角瓶中加入液体培养基 通入无菌空气以增加培养基中的溶氧 量 提供食用菌菌丝体的呼吸代谢所需要的氧气 同时加以搅拌或振荡并控制 适宜的外界条件等 8 2 2 常用的香菇母种培养的方法及其作用常用的香菇母种培养的方法及其作用 2 2 1 根据营养物质的成分分类 a 天然培养基 培养基利用天然有机物配制而成 材料来源广 成本低 制作简单 在生产栽培广泛使用 如马铃薯培养基 豆芽汁培养基 麦粒培养 基 草粪培养基等 b 半合成培养基 在天然培养基中添加无机盐或在合成培养基中添加少量 有机物 这类培养基是根据不同菌类菌丝生长的需要而改良的 有利于促进菌 丝生长 如马铃薯培养基增加硫酸镁 0 5 克 磷酸二氢钾 0 6 克 维生素 B15 毫克时草菇菌丝生长特别旺盛 组分质量份 蒸馏水 1000ml 马铃薯 200g 蔗糖 20g 硫酸镁 0 5g 磷酸二氢钾 0 6g 维生素 B1 5mg 7 c 合成培养基 培养基成分明确 稳定 适合试验 母种分离 菌种贮藏 使用 适合各种菇类菌丝生长及保种 组分质量份 蒸馏水 1000ml 葡萄糖 20g 琼脂 20g 蛋白胨 2g 磷酸二氢钾 0 46g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁 0 5g 2 2 2 根据培养基的状态分类 a 液体培养基 这类培养基不加凝固剂 不保留固态物 多用化合物或固 态物的煮汁制成 在这种培养基中 菌丝生长快速 而且可以根据培养菌丝体 的需要中途补充养分及调节酸碱度 最适合工业发酵用 组分质量份 蒸馏水 1000ml 葡萄糖 20g 氯化钙 0 1g 蛋白胨 2g 微生素 B1 0 1g 磷酸二氢钾 0 5 b 固体培养基 培养基加入凝固剂或固态物质制成的培养基 有较稳定的 形态 1 琼脂培养基 1 斜面培养基 这种培养基可以增大菌丝的扩展面 可以观察菌丝体的生长状态 但由于培养基浅薄 易失水 故保存菌种的时间 不长 2 直管琼脂培养基 这种培养基不摆斜面 基质深厚 保持养分 保水 性好 适合菌种保藏使用 2 草料 麦粒 棉子壳 木屑 甘蔗渣等固形物配制的培养基 3 种木培养基 把树木或木材制成 1 2 1 5 厘米长 1 5 2 厘米粗的 木段 或圆柱状 或锲状 或圆饼状拌入木屑 麸皮制成 接种时取木段种接 Comment u5 不要 8 入段木或袋料中 3 传统固体制种培养基的特点传统固体制种培养基的特点 3 1 优点 优点 3 1 1 发酵培养基中没有游离水的流动 适宜于水活度在 0 93 0 98 的微 生物生长 限制了应用范围 同时也限制了某些杂菌的生长 3 1 2 固态发酵中培养基提供的与气体的接触面积大 供氧充足 同时 空气通过固体层得阻力较小 能量消耗低 3 1 3 使用固体原料 在发酵过程中 糖化和发酵过程同时进行 简化操 作工序 节约能耗 3 1 4 由于产物浓度高 提取工艺简单可控 没有大量有机废液产生 但 提取物含有底物成分 3 2 缺点 缺点 3 2 1 底物浓度存在梯度 发酵不均匀 菌体的生长 对营养物的吸收和 代谢产物的分泌存在不均匀 3 2 2 机械化程度较低 缺乏在线传感仪器 过程控制较困难 3 2 3 接种时操作时间长 增加染菌率 4 液体培养基的配方液体培养基的配方 4 1 此次试验液体培养基的配方 此次试验液体培养基的配方 组分质量份 蒸馏水 1000ml 马铃薯 200g 蔗糖 20g 9 具体制作方法是 将 200g 马铃薯去皮 去芽眼 切成小条放入铝锅中 加 入 1000mL 水 煮沸 10 20 分钟左右至马铃薯软而不烂时 用 6 8 层纱布过滤 取滤汁于锅中 补水至 1000mL 再加入糖搅拌均匀 趁热分装于试管中 4 2 液体培养基的可行性 液体培养基的可行性 液体培养基因营养物质分布均匀 与菌体表面接触充分 还能大量溶解微 生物的代谢产物等优点 广泛用于微生物的生理 代谢研究以及大规模的工业 化生产中 5 试验操作试验操作 5 1 培养基的制作 培养基的制作 其做法是称取 200g 马铃薯 洗净去皮切成小块 加水煮 到酥而不烂 煮沸 10 20 分钟 能被玻璃棒戳破即可 用四层纱布过滤 再据实际实 验需要加葡萄糖 继续加热搅拌混匀 稍冷却后再补足水分至1000 毫升 分装三角烧瓶 加塞 包扎 121 灭菌 20 分钟左右后取出 冷却后 贮存备用 5 2 接种接种 5 2 1 接种子实体 提前半小时打开接种室的紫外灯 如长时间没用超静工作台 可用75 酒 精檫拭台面和壁面 提前十五分钟打开超静工作台的紫外灯和风机 准备试验器材 将其放入工作台中 用75 的酒精对手部进行消毒处理 点燃酒精灯 把酒精瓶中的镊子放在酒精灯的外焰上反复灼烧 后伸入接种 瓶中的瓶壁进行冷却处理 用小指和无名指将装有培养基的试管棉塞在酒精 灯外的无菌处打开 用镊子将相同体积的子实体接种在培养基中 让子实体 处于半漂浮状态 把棉塞在酒精灯外焰进行旋转灭菌处理后 迅速封住试管 标注好名称 时间 编号等 依次进行如此操作三次 5 2 2 接种孢子 10 a 种菇选择 最好选秋菇的二潮菇 在高产的床面上 选取菇形圆整 色 泽纯正 菌肉结实 菇柄粗壮的菇 一般菌盖直径 6 8cm 鲜菇单重 100 150 克 七八成熟 菌膜不能破 如菌膜已破 难以进行表面灭菌 对分离工作不 利 b 表面灭菌 将种菇的菌柄剪去 2 3 在清水中洗去粘附的污物 然后浸 入 0 1 升汞溶液处理 2 分钟 取出后 用灭菌水冲洗 2 3 次 表面灭菌处理的 时间不能太长 以防升汞溶液透过菌膜渗入菌体内 杀伤孢子 然后 用灭菌 纱布或灭菌滤纸吸干菌体表面水分 即可进行分离 c 弹射分离 分离前 要准备的弹射分离装置 用一个直径 13cm 的大培 养皿 或搪瓷盘 作为底盘 上面放一个直径 9cm 的小培养皿 来收集孢子 小培养皿内放一个不锈钢支架 供插种菇用 上面加盖玻璃钟罩 然后将整 个分离装置用双层纱布包好 在 0 15 兆帕压力下灭菌 45 分钟备用 分离时 在无菌室 箱 内打开钟罩 将种菇的菌柄插在支架上 加盖钟 罩后 在钟罩下部放一道纱布或脱脂棉 倒入 0 1 升汞溶液 以纱布 脱脂棉 浸湿为度 主要是防止杂菌侵入及维持分离装置内的相对湿度 然后将分离装 置移至 18 20 处培养 1 2 天 种菇开伞弹射孢子 若室温为 20 通常在 16 小时后即有孢子弹射 培养皿内沉积的孢子 由淡咖啡色转为咖啡色时 应停 止弹射 终止弹射分离后 用纱布蘸取 0 1 升汞溶液 擦洗分离装置的外部 移入灭菌室 箱 内 取出种菇 在落有蘑菇孢子的培养皿上 加盖培养皿盖 供稀释分离或保藏用 9 此次实验我们用稀释分离法对孢子进行接种 通过不断稀释孢子悬浮液 孢子分散最终孢子浓度控制在 300 500 个孢子 毫升 吸取 0 1 毫升的孢子 液注入液体培养基表面 分散孢子各自萌发形成单孢菌落 其步骤如下 制备无菌水试管 取 10 支试管 其中 1 支装 10 毫升蒸馏水 其它 9 支装 9 毫升蒸馏水 经高压灭菌即成无菌水 制孢子悬液 取一小块收集有孢子的滤纸条 浸入 10 毫升无菌水试管中 摇振使孢子分散成悬液 用无菌 1 毫升移液管吸取 1 毫升孢子悬液于第 2 支试管 中 摇振使其混匀 再从第 2 支试管中吸取 1 毫升注入第 3 支试管中 如此反复 稀释直到孢子浓度达到 300 500 个孢子 毫升 接种 Comment u6 不要 Comment u7 一定要针对每一个环 节对应结果 并对之进行分析 11 吸取 0 1 毫升的孢子液注入液体培养基表面 分散孢子各自萌发形成单孢 菌落 标住好名称 时间 编号等 如此操作三次 把上述的接种后的子实体和孢子共六支试管放入已调节好的摇床中 进行 培养 每三天观察记录一次 直到菌丝体较为良好的萌发出来 为增加实验的 科学性和可信度 再如此重复操作三次 排除试验的偶然性 5 3 调节适应生长环境调节适应生长环境 摇床震荡的频率为 130 min 培养温度为 28 培养时间为 9 天 10 5 4 注意事项注意事项 无菌操作必须过关 接种器具禁止放置在操作台上 分离孢子的装置需做好灭菌工作 稀释孢子液应在超净工作台上进行 避免杂菌进入 滴入孢子液时应注意与液体培养基的融合状态 如果太深则影响孢子的繁 殖与萌发 如有被污染的试管应即时取出 在高湿 高温不通风的条件下更容易受霉 菌污染 应及时避免 试验过程中应做好记录工作 为试验数据提供条件 打下基础 6 结果分析结果分析 经试验后得到以下数据 分别为 5 月 12 日 19 日 29 日用孢子培养出的 培养液和用子实体培养出的培养液的吸光度 孢子子实体 0 8660 851 0 8840 875 1 0430 987 1 9381 661 由表中可得 稀释的倍数越小其吸光度越大 孢子的吸光度明显大于子实 体的吸光度 初步证明孢子萌发的菌丝比子实体萌发的菌丝多 浓 Comment u8 表格设置有问题 表 头与数据之间无联系 Comment u9 具体数据 Comment u10 要有具体数据 12 孢子子实体 0 8360 850 0 8830 871 1 012 0 965 1 9031 650 由表中所得 此时间段的吸光度在前两次的吸光度相差并不是很大 后两 次的吸光度相差较为明显