地中海贫血基因检测和结果分析PPT课件.ppt

1 地中海贫血的实验室检测和结果分析 2 主要内容 一 什么是地中海贫血及分布二 地中海贫血的致病机制三 地中海贫血的基因诊断四 最新的地中海贫血检测方法五 检测结果分析及报告 3 一 什么是地中海贫血 定义 由于珠蛋白基因发生缺陷 致使珠蛋白肽链合成减少或缺失 导致血红蛋白的 链 非 链比例失衡 而引起的一组遗传性溶血性疾病 亦称海洋性贫血 血红蛋白病 由于珠蛋白基因发生缺陷 致使珠蛋白分子的一级结构发生改变 从而导致血红蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病 地中海贫血是最常见的血红蛋白病 珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼 国外不用 4 地中海贫血分类 5 地中海贫血分类 1 按照一个单倍型上的 珠蛋白基因的功能缺陷定义 0地贫 也有称 地贫1 珠蛋白基因完全基因记为 丧失功能 地贫 也有称 地贫2 珠蛋白基因保基因记为 留有部分功能 6 地中海贫血分类 2 按照肽链内切酶分型 缺失型地贫 珠蛋白肽链存在片段缺失而造成功能缺陷 非缺失型地贫 珠蛋白肽链上不存在缺失 而是 点突变 由于基因的点突变造成的肽链功能缺陷 7 地中海贫血分类 3 根据 基因缺失或突变个数可分为 静止型 缺失1个 基因 基因型记为 1个 基因突变 基因型记为 T轻型 缺失2个 基因 基因型记为 或 2个 基因突变 基因型记为 T T中间型 缺失3个 基因 基因型记为 缺失与突变混合 基因型为 T或纯合突变重型 缺失4个 基因 基因型记为 缺失与突变混合 基因型为 T 8 地中海贫血分类 1 根据肽链的功能缺失 0地贫 珠蛋白基因功能完全丧失 不能合成肽链 地贫 珠蛋白基因尚保留部分功能2 根据临床症状静止型 地贫 突变杂合子 N 中国人少见轻型型 地贫 突变杂合子 N 0 N 中间型 地贫 突变双重杂合子 突变纯合子 0 重型 地贫 突变双重杂合子 突变纯合子 0 0 0 9 中国人HPFH和 地贫的基因突变类型及表型特征 10 世界地中海贫血的流行分布 11 广西地中海贫血的流行分布 Xiong etal ClinGenet2010 12 广西地中海贫血的流行分布 13 引起 珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布 MC 10kb 0kb 20kb 30kb 40kb 10kb 3 HVR inter HVR 5 3 2 1 2 1 THAI BRIT FIL MED SEA 4 2 3 7 2 7 SPAN HW 27 6 11 1 2 4 14 BlackBelgianIndianMalaysian2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS E AsianTaiwanese 0kb50kb100kb150kb G A LCR 引起 地中海贫血常见的基因缺失突变类型分步 15 12种见于中国人群的 2 1珠蛋白基因点突变 CD31 CD125 EXONI EXONII EXONIII IVSI IVSII UTR UTR 5 3 CD13 CD59 CD122 CD142 CD44 CD49 CD30 2 1 Missensemutation Minideletionorinsersion Terminationmutation Frameshift http globin cse psu edu CD78 CD74 CD118 16 启动子突变异常剪接起始密码突变移码突变无义突变3 UTR突变 EXON1 IVS1 EXON2 EXON3 IVS2 显性突变 5 3 46种见于中国南方人群的 珠蛋白基因点突变 http globin cse psu edu 17 中国南方人群最为常见的地贫类型 18 二 地中海贫血的致病机制 胎儿血红蛋白主要由两条 珠蛋白链 两条 珠蛋白链组成 还含有 链 链 链组成 成年人的血红蛋白由两条 珠蛋白链和两条 珠蛋白链组成 血红蛋白 19 二 地中海贫血的致病机制 20 二 地中海贫血的致病机制 人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律 21 二 地中海贫血的致病机制 静态突变 点突变 片段突变 动态突变 碱基替换移码突变 串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加 缺失重复重排 基因突变的分子机制 基因致病突变是地贫发生的分子基础 22 二 地中海贫血的致病机制 23 三 地中海贫血基因分析 1 Gap PCR用于 和 等缺失型地贫的检测 原理 普通的酶无法扩增出长距离的片段 通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物 当存在缺失时 由于肽链靠近从而扩增出片段 24 25 三 地中海贫血基因分析 2 PCR RDB用于检测 和 点突变 PCR 膜条 杂交 显色 26 27 三 地中海贫血基因分析 地贫基因检测的策略 地贫 先检测常见缺失型 然后检测非缺失 点突变 最后是未知的缺失和突变位点 因为 90 地贫为常见的三种缺失型 sea 3 7 4 2 地贫 先检测点突变 然后检测少见的缺失型 大部分 地贫都是点突变型 28 血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程 29 遗传咨询 产前地贫携带者筛查策略 同时正常 产检对象 孕妇及其配偶 地贫分子诊断 知情同意选择 胎儿产前基因诊断 血液五分类分析 关注MCV和MCH 血红蛋白电泳 HbA2 双方某项指标均同时降低 一方正常 另一方的指标降低 地贫全套检查 异常的一方做地贫全套检查 地贫特征 地贫特征 ID 双方均为 地贫特征 一方为 地贫特征 另一方为ID或 地贫特征 单纯性ID或单纯性 地贫 双方均为 地贫特征 ID或 地贫特征的一方做 地贫分子诊断 夫妇双方基因诊断 血R正常的一方做 地贫分子诊断 单纯性ID或单纯性 地贫 仅异常血红蛋白 必要时测序或选择其中一种地贫检测 30 四 最新的地中海贫血检测方法 1 融链曲线分析法用于检测 或 缺失和点突变 Thongperm etal JournalofMolecularDiagnostics 2010XiongF etal JMolDiagn 2011ChristinaV etal ClinicalChemistry 2003 原理 根据每条肽链都有自己的Tm值 从而可以通过温度差来判断 31 四 最新的地中海贫血检测方法 2 MLPA 多重连接探针扩增 用于寻找未知缺失断裂点 Xiao FengWei etal AnnHematol 2011 32 四 最新的地中海贫血检测方法 3 毛细管电泳可以检测 非缺失CS HbCS 和 E地贫 HbA HbE HbA2 CanLiao etal EuropeanJournalofHaematology 2010 33 四 最新的地中海贫血检测方法 4 DHPLC 变性高效液相色谱 用于缺失型和突变型地贫都可以 李倩 南方医科大学论文 2010 34 四 最新的地中海贫血检测方法 5 基因序列测定 PCR 毛细管电泳 用于未知突变位点或确定缺失片段的位置由于仪器比较贵重 技术要求高 目前尚未在临床一线推广 只在科研实验室里开展 AzamAmirianMSc etal ArchivesofIranianMedicine 2011 35 四 最新的地中海贫血检测方法 6 母体血浆中胎儿游离核酸的测定 严提珍 国际输血及血液学杂志 2009 36 严提珍 国际输血及血液学杂志 2009 37 五 检测结果分析及报告 一 地贫基因诊断 1 SEA 2 3 4 SEA 4 25 SEA 4 26 SEA 3 77 8 SEA 9 DNAMarker 缺失型地贫电泳结果 123456789 38 非缺失杂交结果 CS纯合 WS杂合 未检测到6种突变 注意不是正常 39 A B C D E F 地中海贫血点突变分析结果 40 血涂片染色 包涵体 CornelisLH OrphanetJournalofRareDiseases 2010 41 五 检测结果分析及报告 三 基因诊断报告单1 临床地贫基因报告主要是常规试剂可以检测到的类型 一般都会包括被测样本的信息 检测方法 检测试剂