Exp.4肉品中蛋白質之測定1.doc

Exp.4 肉品中蛋白質之測定 （1）一. 背景蛋白質是肉類中的主要成分，約佔肉總固形物的80。肌肉中蛋白質依據其特性及溶解性，大致上可分為肌漿蛋白質（sarcoplasmic protein）、肌原纖維蛋白質（mtofibrillar）及基質蛋白質（stroma protein），分別佔總肌肉蛋白質中的3034、5055及1015。 （整理自林，1988；林，1995）蛋白質所含有的元素之含量約：碳50-55，氫6-8，氧20-23，氮15-18，硫0-4。蛋白質與其他食品成分不同之處，在於構成元素中含有氮，通常蛋白質平均含氮量為16，因此在食品的蛋白質定量，測定食品中的含氮量，然後乘以氮係數 （nitrogen factor；氮1g所相當的蛋白質量100/16=6.25），即可求出蛋白質含量。由於食品中除了蛋白質外，還包括非蛋白質氮化合物，如游離胺基酸、小胜肽核酸、胺基、肌酸、尿素、生物鹼等，因此這方法所得的蛋白質稱為粗蛋白 （crude protein）。氮係數是由蛋白質的元素組成來決定，但是氮量依蛋白質的種類有稍微差異，因此食品的氮係數以食品中的主要蛋白質的氮含量為基礎來決定。下表一為中國國家標準 （CNS）所規範之各種食品計算蛋白質含量之含氮係數。表一. CNS所規範之各種食品之含氮係數食品名稱含氮係數食品名稱含氮係數乳及乳製品6.38蛋或肉6.25米5.95栗、胡桃5.30大豆及豆製品6.25南瓜、西瓜5.40大麥、燕麥5.83 資料來源：CNS 5035（N6116）粗蛋白質的測定方法是1883年由Kjeldahl建立現在凱氏氮定量法 （Kjeldahl method） 的基本方法分析氮量，目前廣泛應用於食品、飼料、環境等天然物所含的含氮化合物的定量，時至今日已經過許多改良。下表二則列出了一些常見肉品中的基本成分百分比。（整理自李，1992）表二. 一些常見肉品中的基本成分百分比Meat source and physical statePercentCalories per 100 gmProteinMoistureFatAshBeefRaw20.94 71.60 6.33 1.03 147.00 Cooked30.42 57.75 10.24 1.21 222.00 Chicken, light meatRaw23.20 74.66 1.65 0.98 114.00 Cooked30.91 64.76 4.51 1.02 173.00 Chicken, dark meatRaw20.08 75.99 4.31 0.94 125.00 Cooked27.37 63.06 9.73 1.02 205.00 HalibutRaw20.90 76.50 1.20 1.40 100.00 Cooked25.20 66.60 7.00 1.70 171.00 LambRaw19.50 71.50 7.00 1.50 145.00 Cooked27.00 61.50 8.50 2.00 200.00 PorkRaw20.22 71.95 6.75 1.04 147.00 Cooked27.04 58.97 13.04 1.10 233.00 VealRaw20.00 75.00 3.50 1.00 130.00 Cooked29.00 63.00 5.50 1.60 175.00 圖表來源：U.S. Department of Agriculture Handbook Nos. 8, 8-5, 8-10, and 8-13. 二. 目的本實驗使用凱氏氮定量法( Kjeldahl method) 測量絞碎羊腿肉中粗蛋白質的含量。三. 原理測定樣品中的全氮量且將此值轉換成蛋白質百分比。在樣品中加入濃硫酸，並加熱使其分解，於是含氮化合物中的氮就會變成銨鹽（酸銨）而存在於濃硫酸中，當加鹼使之為鹼性並加熱時，即放出氨，以水蒸氣蒸餾蒸出後，並用一定濃度的酸液捕集所趨出的氨，以酸進行滴定並計算。大致上可以分為三部份：分解、蒸餾、滴定。A. 分解將樣品與硫酸起加熱分解，硫酸會使樣品脫水，並破壞其中的有機物，使有機物的碳和氫被氧化生成二氧化碳和水，經過加熱而蒸發，蛋白質分解產生氮，氮與硫酸結合生成硫酸銨，並殘留在酸性的溶液中，而二氧化碳和水則經過加熱而蒸發。RCHNH2COOH H2SO4 CO2 H2O (NH4)2SO4B. 蒸餾經過分解後，樣品中的硫酸銨加水稀釋後，與鹼作用會產生氨氣，經由蒸餾收集至含有次甲基藍和甲基紅混合指示劑的硼酸溶液中。(NH4)2SO4 2NaOH 2NH3 Na2SO4 2H2O2NH3 2H3BO3 2NH4H2BO3 C. 滴定 利用鹽酸標準溶液直接滴定所產生的硼酸根離子。 2NH4H2BO3 2HCl 2NH2Cl 2H3BO3 H2BO3 H H3BO3（整理自李，1992）四. 材料與儀器設備（一）材料：絞碎羊腿肉（二）藥品1. 催化劑 （消化錠，K2SO4CuSO4）（Sorenson BioScience, Inc., Salt Lake City, U.S.A.）2. 18 N濃硫酸 （98）（聯合化學股份有限公司，新竹市，台灣）3. 沸石 （boiling stone）（林純藥工業株式會社，大阪，日本）4. 4硼酸 （4 boric acid）取20 g的硼酸 （boric acid, H3BO3）（片山試藥株式會社，大阪，日本），加蒸餾水定量至500 ml。5. 40氫氧化鈉溶液 （40 sodium hydroxide）取400 g的氫氧化鈉 （sodium hydroxide,NaOH）（聯工化學廠股份有限公司，新竹，台灣） 於燒杯中溶解後，以蒸餾水定量至1 L。6. 1N HCl 標準溶液取8.33 ml 12 N濃硫酸 （hydrochloric acid, HCl）（聯工化學廠股份有限公司，新竹，台灣），以蒸餾水定量至1 L。7. 指示劑 （BG-MR solution） （1）溴甲酚綠 （bromocresol green,BG） 指示劑取0.1 g 溴甲酚綠（Fluka, Switzerland），以95乙醇（ethanol）定量至100 ml。【註】溴甲酚綠 C21H14Br4O5S，分子量為698.05。微黃色晶體，熔點為218-219，可溶於乙醇、乙醚、乙酸和乙酯，對鹼很敏感，可作為酸鹼指示劑，pH3.8時呈黃色，pH5.4時呈藍綠色。 （2）甲基紅（methyl red, MR）指示劑取0.1 g甲基紅（三德藥品株式會社，大阪，日本），以95乙醇（ethanol）定量至100 ml。【註】甲基紅 HOOCC6H4HNC6H4N(CH3)2，分子量為269.29。C.I.No. 13020。暗紅色粉末或紫色晶體，會發光物質。熔點為180，可溶於乙醇、乙醚和冰醋酸，不溶於水。 pH範圍在4.2-6.2，顏色會由紅轉黃，可作為酸鹼指示劑。 （3）BG-MR指示劑將5 ml溴甲酚綠 （BG） 指示劑與3.5 ml甲基紅 （MR） 指示劑混合均勻。（三）儀器設備1. 消化器 （Tecator, Digestion system 6 1007 Digestor, Sweden）2. 蒸餾機 （Tecator, Kjeltec system 1002 Distilling unit, Sweden）3. 滴定器 （Brand, Brette Digital , Saxony, Germany）五. 實驗步驟（一） 肉品之前處理取先前已絞碎的冷凍肉，置於4下解凍天。（二） 凱氏氮定量法（Kjeldahl method）之實驗步驟消化 （注意：消化步驟必須在hood中進行）1. 準備7支消化管。將其中6支消化管放置於消化管的專用鐵架上，並做標示，另支消化管放置他處備用。2. 於6支消化管中加入1顆消化錠及3-5顆沸石3. 以秤量紙精秤1 g樣品後包裹起來，置入消化管中。4. 在每支消化管中加入20 ml的濃硫酸。【注意】每次進行消化時，在6支消化管中都要保留支消化管當作空白試驗。空白試驗的內容物有：秤量紙、消化錠、沸石、濃硫酸。5. 將消化器插上110v的電源，開啟power並將溫度設定為420 。 【註】一手按住 SET 鍵，手按壓 做溫度的設定。6. 將6支消化管置於消化機上，蓋上抽氣蓋後打開抽氣水龍頭。7. 當加熱分解時，顏色由黑褐色 黃綠色 無色、澄清透明，即表示分解完全，此時可將power關掉，取出消化管並放置在hood的操作台上冷卻。8. 緩慢地將75 ml蒸餾水加入消化管中。 【注意】必須在冷卻之後才可加蒸餾水。若是太熱加水，會導致消化管內反應激烈以及樣品流失。太冷加水則會有鹽類的沉澱發生，難再溶解，此時可以將消化管放於消化器上加熱數分鐘。蒸餾 1. 將蒸餾機插上220V的電源後，開啟power與出水閥，調整好蒸氣出量與水流量的平衡。【註1】上面的水流最好達到外高內低的狀態才易於水流的平衡。 【註2】蒸氣瓶內的水位只要淹過電極圈即可。 【註3】蒸餾機後面有兩個黑色的小轉鈕，必須要關。2. 在備用的消化管中，加入150 ml的蒸餾水，取一燒杯連同消化管置於固定位置上後，關上保護門。3. 開起蒸氣閥，進行蒸餾一段時間，讓蒸餾水能夠流過冷凝裝置的內管，達到清洗的目的即關閉蒸氣閥，停止蒸餾。 【註】每個樣品進行蒸餾的前後，都要用裝有蒸餾水的消化管蒸餾一次， 目的為清洗冷凝管中的殘留物。4. 在已標線150 ml刻度的三角錐形瓶中，加入60 ml的4硼酸作為接收液，並加入2滴BG-MR指示劑，此時接收液的顏色由透明無色變為淺紫紅色。5. 將消化管和裝有4硼酸接收液的三角錐形瓶置於固定位置上後，關上保護門。6. 加入75 ml的40 NaOH到消化管中，此時消化管中溶液顏色變成淡綠色。 【注意】加入75 ml的40 NaOH後，必須呈現淡綠色，否則無法將樣品中的氨氣蒸餾出來。7. 開啟蒸氣閥，開始蒸餾，直到三角錐形瓶中的硼酸接收液加上蒸餾液的總體積達150 ml即關閉蒸氣閥，停止蒸餾。 【註】蒸餾過程中，硼酸接收液會由淺紫紅色變成淺綠色。 【注意】建議先將三角錐形瓶取出再關閉蒸氣閥，以免樣品倒抽。8. 所有樣品蒸餾完後，就可關閉蒸餾機的power與出水閥，之後再拔掉插頭。 滴定1. 使用滴定器，先將蒸餾後的空白組接收液以0.1 N HCl 滴定至淺紫紅色，並記下滴定量。2. 再將其它蒸餾後的接收液以0.1 N HCl滴定至與空白組致的淺紫紅色，並記下滴定量。3. 計算樣品中粗蛋白質的含量。蛋白質 （）=（V1-V2） 0.0014 N.F 100 / WV1：樣品所消耗HCl的滴定量 （ml）。V2：空白試驗所消耗HCl的滴定量 （ml）。N.F：氮係數6.25。W：樣品重量 （g）。0.0014：相當於1 ml 0.1N HCl的氮量。六. 實驗結果 組別二樣品重（g）1.00 1.02 1.00 1.00 1.01 1.00 1.01 空白組滴定量（ml）0.720.72 0.72 1.30 1.30 1.30 1.30 樣品滴定量（ml）20.3124.54 23.76 31.66 30.11 29.61 27.26 蛋白質（）17.14 20.43 20.16 26.57 24.96 24.77 22.49 平均（）19.25 24.70 標準機差（）3.95 1.68 七. 討論八. 參考文獻1. 陳明造（2000）肉品加工理論與應用，pp.451-452，藝軒圖書出版