高通量的转录因子活性检测.doc

高通量的转录因子活性检测摘要： 一种特定的细胞信号通道通常可同时激活多种转录因子，一个特定基因的表达在多种转录因子的控制之下，因此同时检测多种转录因子的活性对理解细胞调控的分子机制至关重要。这时，EMSA就无能为力了。为此，美国Signosis 公司推出了TF活性检测微孔板阵列试剂，可同时检测多种转录因子的活性。该试剂包括I和II，分别可检测48种和96种不同的转录因子，包括NFkB、AP1、HIF1和p53等。转录因子（transcription factor，TF）在真核生物的基因表达过程中发挥着重要作用，或调节基因表达的强度，或控制目的基因的时空特异性表达，或应答外界刺激和环境胁迫。近年来，随着干细胞研究的不断升温，人们对转录因子的兴趣也日益浓厚。同一个基因组，为何最终分化成不同的表型，这正是转录因子让人着迷的地方。生物通 过去，对于转录因子的活性检测，人们常常采用电泳迁移率改变分析（EMSA）。这是一种经典技术，过去通常采用32P放射性同位素标记的DNA显现实验结果，需要数天。当然，现在也采用化学发光检测来取代同位素。不过，EMSA 操作相当繁琐，整个过程包括了核蛋白的抽提、定量，探针的标记与纯化，探针与蛋白质的结合，电泳与显影等若干步，且每次只能检测一个转录因子。然而，一种特定的细胞信号通道通常可同时激活多种转录因子，一个特定基因的表达在多种转录因子的控制之下，因此同时检测多种转录因子的活性对理解细胞调控的分子机制至关重要。这时，EMSA就无能为力了。 为此，美国Signosis 公司推出了TF活性检测微孔板阵列试剂，可同时检测多种转录因子的活性。该试剂包括I和II，分别可检测48种和96种不同的转录因子，包括NFkB、AP1、HIF1和p53等。分析的原理如下图。首先根据转录因子DNA，制备一系列针对不同转录因子的生物素标记探针。然后将探针混合物与核抽提物混合。各探针与其相应的转录因子结合，形成转录因子/探针复合物。通过简单的柱离心纯化，保留与转录因子结合的探针，去除游离探针。之后洗脱结合的探针，通过板杂交方法确定结合探针的序列以进一步确定对应的转录因子。捕获的DNA探针用链酶亲和素-HRP检测。最后利用化学发光检测仪测定发光强度（RLUs）。这种方法步骤简单，无需Luminex等贵重仪器，即可同时测定48或96种转录因子的活性，是高通量分析的理想选择。此外，这种方法还能定量分析和比较两个样本的差异。干细胞的转录因子分析 近年来，因医疗方面的前景广阔，无论是胚胎干细胞，还是诱导多能干细胞，都成为研究的热点。干细胞能够自我更新或者分化成多种类型的细胞，这种能力是由细胞信号传导和转录调控所控制的，因此转录调控在细胞识别和功能实现过程中起决定作用。干细胞逐步成熟，形成终末分化细胞，需要由重要的转录因子适时地激活级联转录程序。据报道，多种转录因子与干细胞的自我更新和多能性有关。分析这些转录因子的活性可为干细胞的研究和应用提供有价值的线索。Signosis公司也专门开发出一种干细胞转录因子活性多重检测阵列试剂，可同时分析哺乳动物样本中16种干细胞特异的转录因子，包括EGR1、OCT4、FOXD3、FOXO1、Nanog、SOX2、SOX18、ETS、GLI、KLF4、MEF2、Myc、RNUX1、Pax6、TCF/LEF和GATA。这种方法的原理同上，可利用1000-10000个细胞的全细胞裂解物开展。 启动子结合的转录因子分析以上介绍的转录因子活性检测方法还可用来确定某一启动子结合的转录因子。传统上，若要确定与特定启动子结合的转录因子，或通过上游启动子来调控特定基因表达的转录因子，一般采用两种方法。第一种，也就是上文提到的EMSA。第二种，敲除某个转录因子的结合位点，以测定与启动子连接的报告载体的表达是增加还是减少，这通常需要构建一系列启动子缺失或突变的报告体，因为一个或多个转录因子在启动子上有多个结合位点。Signosis公司通过改进的TF检测微孔板阵列方法来实现启动子的鉴定。这种方法可检测48种转录因子是否与启动子结合。这种试剂其实就是上面介绍的转录因子活性检测微孔板阵列试剂I的竞争法。在结合启动子的TF微孔板阵列检测试剂中，将含有感兴趣启动子的PCR片段与一套48种生物素标记的探针混合，48种探针与待测标本中的48种转录因子相对应。如果DNA片段含有转录因子结合序列，那么它就与生物素标记的探针竞争与样本中的转录因子结合，不形成或少形成复合物，也就检测不到或少检测到转录因子。通过竞争质粒或DNA片段存在与否时的比较，即可确定启动子结合的转录因子。 另外，Signosis还提供了一种基于报告基因的多重转录因子检测。它可同时定量检测24种转录因子的活性。该技术构建一系列报告载体，每一种含有一个顺式因子和针对一种特异转录因子的载体标识序列。当载体作为文库加入96孔板某一孔中，转录因子的激活将使其与相应的载体结合，介导标示序列的表达。细