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高级植物生理学实验报告植物组织培养摘要：植物组织培养在植物育种，种植等方面已经有了较成熟的技术，本实验以高羊茅种子为外植体在MS培养基中进行植物组织培养，并观察其生长情况及发芽率等指标。通过亲自体验加深了对植物组织培养的认识，并能熟练的掌握其技术。实验结果表明组织培养可以使种子发芽率达到90%以上。关键词：植物组织培养；高羊茅；MS培养基引言：植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术1。它是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，进而培育成完整的植株，统称为植物组织培养。运用组织培养法可以生产脱毒苗，对繁殖系数低、不能用种子繁殖的名、优、特植物品种进行快速大量的繁殖，单倍体育种、促进远缘杂交种的细胞融合、利用基因转入的方法培育出抗病虫害等的品种，生产出大量的胚状体用以制作人工种子，大量生产植物次生代谢物等2。目前，植物组织培养技术已渗透到植物生理学、病理学、遗传学、育种学、药学以及生物化学等研究领域，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一，推动了相关学科的迅速发展。特别是植物组织培养技术与分子生物学及RNA干扰技术紧密结合，成为细胞生物学和细胞遗传学研究的基础。植物组织培养技术还被广泛应用于农业、林业、工业、医药业等多种行业，从而在生产实践方面产生了巨大的经济效益和社会效益3。1 我国植物组织培养研究进展从20世纪50年代我国植物组织培养创始人之一罗世韦4教授在中国科学院上海植物生理研究所开展了组织培养的研究以来，我国组培技术研究快速发展，在近10多年来全国各地许多农业科研院和高校都开展了植物组织培养研究工作，对农作物、观赏植物、园艺作物、经济林木等上千种植物进行组织培养研究并取得了成功，同时在实践中总结出很多有益的经验，如郑文静5等较好地总结了植物组织培养中的常见问题和具体解决方法；吴毅明等在植物组织培养的环境微生态的研究中，用通透性好的化学纤维、纸卷、蛭石、沙子等代替琼脂作培养基，可有效地改善根际环境，促进小植物生根；刘思九6采用的暴露培养法，即在敞口培养器中用特制的粉沫状灭菌材料覆盖培养基和外殖体，使其不受污染，通过特制装置补水，让组培苗暴露在室内空气中生长，其长势优良，不炼苗即可移栽。肖玉兰7等研究的无糖箱式培养法(培养基不放糖，在培养瓶内用特殊装置注入CO2，然后加强光照35倍，小植物能进行光合作用自给养分)，使植株生长量成倍增长，有效地降低了生产成本。随着植物茎尖培养脱病毒技术以及离体快繁技术日趋成熟，20世纪90年代以来全国各地相继建立了一批工厂化试管苗繁育基地，在马铃薯、草莓、香蕉、甘蔗、桉树、杨树以及一些花卉上已有商业化的试管苗生产体系，产生了良好的经济效益和社会效益，形成了“兰花工业”、“香蕉工业”1。并且在对外开放以来，我国各农业科研院所、高等院校和组培中心在组织培养技术领域积极开展对外的技术交流与合作，借鉴和学习荷兰、美国、加拿大、英国等组培产业发达国家的成功经验，从而使国内组培产业得到了较大的发展1。2 实验材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验仪器电子天平，烧杯，量筒，移液管，玻璃棒，称量纸，PH试纸，锥形瓶瓶、酒精灯、镊子、培养皿等。2.1.2 实验试剂95%乙醇、琼脂，蔗糖，蒸馏水，1mol/L NaOH、1mol/L HCl、MS培养基各成分试剂、植物生长调节剂类即2，4-D、6-BA、IAA、NAA等。2.1.3 接种材料高羊茅草种2.2 实验原理植物组织培养的原理是细胞全能性。也就是说每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。组织培养基于此原理就可以将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。2.3 实验步骤2.3.1 母液的配置本实验采用MS培养基，该培养基由多种大量元素、微量元素、有机成分、铁盐等组成，由于各种成分含量不同，因此各种母液必须分别配置，见下表：表1 MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量母液化合物名称培养基用量（mg/L）扩大倍数称取量(mg)母液体积(mL)1L培养基吸取母液量（mL）大 量 元 素KNO31，90010 4，750250100NH4NO31，6504，125MgSO47H2O3709，25KH2PO4170425CaCl22H2O4401，100表2 MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量母液化合物名称培养基用量（mg/L）扩大倍数称取量(mg)母液体积(mL)1L培养基吸取母液量（mL）微 量 元 素MnSO44H2O22.310022310010ZnSO47H2O8.686H3BO36.262KI0.838.3Na2MoO42H2O0.252.5CuSO45H2O0.02510ml CoCl26H2O0.02510ml表3 MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量母液化合物名称培养基用量（mg/L）扩大倍数称取量(mg)母液体积(mL)1L培养基吸取母液量（mL）铁盐Na2-EDTA37.310037310010FeSO47H2O27.8278表4 MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量母液有机物名称培养基用量（mg/L）扩大倍数称取量(mg)母液体积(mL)1L培养基吸取母液量（mL）有机 物甘氨酸2.01002010010VB10.44VB60.55烟酸0.55肌醇100.01配制激素母液时应注意，各激素的溶剂不同，具体见下表。表5 植物组织培养中常用植物激素及生长调节物质的溶剂中文名缩 写溶 剂2，4-二氯苯氧乙酸2，4-DNaOH/乙醇吲哚乙酸IAA NaOH/乙醇-萘乙酸-NAA NaOH/乙醇6-苄基氨基腺嘌呤6-BANaOH/ HCl2.3.2 MS培养基的配置配制1000ml的用量，用量筒量取870 mL的蒸馏水加入烧杯，称取琼脂7g、蔗糖20g，加入烧杯，在电炉上加热、煮沸，使琼脂溶化，等琼脂完全溶化后，大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机物母液10ml，均匀搅拌。待温度降至5060时，用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调pH值到5.8，然后将培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中(温度低于40以下琼脂就会凝固)，每瓶25mL左右，1000mL培养基可以分装至4050瓶，迅速扎好瓶口，写上标记。将配制好的培养基进行高压蒸汽灭菌后即可使用。2.3.3 培养基和培养用具的灭菌本次实验采用高压蒸汽灭菌，用牛皮纸或铝箔把经洗涤干燥的玻璃器皿以及其他用具包扎好。小器皿可以放在搪瓷盘中一起包扎。用500mL广口瓶装取300400mL蒸馏水，封口、灭菌后制备无菌水。把装有培养基的培养瓶、装有蒸馏水的玻璃瓶和包扎好的玻璃器皿、以及其他用具，放入高压灭菌器。接通电源，设置灭菌时间和温度，一般压力达108kPa，锅内的温度为121时，保持1520min即可达到灭菌效果。2.3.4 外植体的灭菌与接种选取健康的高羊茅草种，用清水漂洗后，在接种台上进行消毒处理。用蘸有70%乙醇的棉球擦手及接种台面和四周。将种子放入灭菌用的小烧杯中，先用少量75%乙醇（浸没种子即可）浸泡1030s，用过的乙醇回收后可重复使用23次，用无菌水冲洗1次后废液倒入废液缸中；再用2%NaClO溶液（浸没种子即可）浸泡2030min，用无菌水冲洗34次后废液倒入废液缸中。用无菌滤纸吸干种子上的水分，置于无菌培养皿中的无菌滤纸上，用镊子固定材料。将接种工具插入95%乙醇中，再取出放在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后使用。用酒精棉球将装培养基的三角瓶从上至下擦拭消毒。取掉盛有培养基而未接种的三角瓶上的封口纸，左手握培养瓶，并将瓶口斜对乙醇灯火焰，用无菌镊子将外植体夹入培养瓶内，材料的放置应注意极性。接种时，瓶口要在火焰附近，瓶身倾斜，以免病菌落入瓶内，接种后立即封口，写好标记。接种后的培养基置于25、2000Lx光照下培养，1周后，观察有无污染的出现。2.3.5 离体组织的形态观察观察各种外植体的接种和生长状况即培养物的大小、形态、颜色的变化等，识别愈伤组织、不定根、不定芽、丛生芽或胚状体的形态，统计褐变率、污染率、成活率等。2 结果与分析实验与2014年12月14日进行，每个人接种两个培养皿，平均每个培养皿中接种六行草种，在接种过程中尽量挑选饱满的种子。分别于12月14日、12月18日、12月22日对培养皿进行观察并拍照，见下图： 图1 12月14日 图1 12月18日 图1 12月22日 经过观察发现：12月18日的时候部分种子长出小芽，并在种子顶端有毛状物质，在12月22日的时候两个培养皿的发芽率均达到了90%，并且可以进行移栽。两个培养皿均无污染。3 讨论3.1 SM培养基的选用实验采用MS培养基，该培养基优点是：无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较适合，可以满足植物的营养和生理需要。其硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的种子、器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。不难发现MS培养基的适用范围较广，这也是相对于其它培养基的优点。3.2 灭菌时的注意事项灭菌时应选取健康的种子，用清水漂洗后，在接种台上进行消毒处理。用蘸有70%乙醇的棉球擦手，擦试接种台面及四周。再用2% NaClO溶液浸泡种子2030min，用无菌水冲洗34次后废液倒入废液缸中。3.3 接种的要点接种过程中应将接种工具插入95%乙醇中，用时取出放在乙醇灯上灼烧灭菌，冷却后使用。左手握培养皿，并将瓶口斜对乙醇灯火焰，用无菌镊子将高羊茅种子夹入培养皿内，材料的放置应注意极性。接种时，皿口要在火焰附近，瓶身倾斜，以免病菌落入瓶内，接种后立即封口，写好标记。参考文献：窗体顶端1 郝玉华. 我国植物组织培养的发展现状与前景展望J. 江苏农业科学,2008,04:20-23.2 梁称福. 植物组织培养研究进展与应用概况J. 经济林研究,2005,04:99-105.3 胡彦,赵艳. 植物组织培养技术的应用以及在培养过程中存在的问题J. 陕西师范大学学报(自然科学版),2004,S1:130-134.4 胡选萍. 我国植物组织培养研究进展J. 安徽农业科学,2008,10:4095