八肋游仆虫中心蛋白质和功能的研究.doc

八肋游仆虫中心蛋白性质和功能的研究【摘要】：中心蛋白是EF-hand钙结合蛋白，是钙调蛋白超家族中的一员。它含有4个EF-hand结构基元，每个结构基元能结合一个钙离子，是很多生物体(如藻类、酵母、原生动物、高等植物、哺乳动物等)的中心体(基体或纺锤极体)的重要组成部分。中心蛋白在细胞的正常分裂以及包含中心蛋白的纤维系统收缩中起重要作用。八肋游仆虫是一种进化上处于特殊地位的单细胞真核生物，存在于八肋游仆虫的中心蛋白是由168个氨基酸残基组成的单肽链酸性蛋白质，分子量约为20KD，不含半胱氨酸和色氨酸。对该中心蛋白的研究，不仅有助于阐明低等真核生物的细胞分裂、细胞运动等重要生命活动过程的本质，而且将其用作稀土离子进入生物体细胞内的主要靶蛋白的模型，对深入研究稀土生物学效应的化学基础具有重要意义。首先利用PCR技术，在野生型八肋游仆虫中心蛋白的基础上得到4个定点突变体(G115W、D37K、D73K、D146K)和2个截短中心蛋白分子(P23、P123)的基因片段，序列测定表明构建的基因片段和预期的设计相吻合。采用基因重组技术，将这些不同的目的基因片段分别与表达载体pGEX-6p-1连接，转入大肠杆菌BL21菌株，分别获得重组菌，经IPTG诱导实现可溶性融合蛋白表达。经GST亲和层析和HitrapQ离子交换层析两步纯化，获得了115色氨酸、37、73、146位赖氨酸突变蛋白，以及包含62-137和1-137位氨基酸的截短蛋白P23和P123。纯度达95以上。在生理条件下运用紫外差光谱、圆二色谱和荧光光谱研究了中心蛋白与钙、铽离子的结合性质。圆二色谱、紫外差光谱测定表明，钙、铽离子与蛋白质的结合都能引起蛋白质二级结构发生变化、螺旋含量增加、酪氨酸残基的化学微环境改变。TNS疏水探针监测钙离子和铽离子诱导蛋白质构象变化及钙和铽引起中心蛋白的共振光散射现象都表明铽离子和钙离子与中心蛋白结合有相似的性质。因此，使用能与蛋白质结合后表现明显荧光敏化的铽离子为荧光探针研究中心蛋白的金属离子结合性质是合理可行的。中心蛋白酪氨酸与铽离子无辐射能量转移的铽敏化荧光滴定表明野生型中心蛋白的四个钙离子结合部位可分为两类：N-端、位点为低亲和位点，C-端、位点为高亲和位点；突变蛋白G115W的铽敏化荧光滴定表明，C-端的两个金属离子结合部位结合金属能力是不等同的，第位点的结合能力大于第位点；D37K、D73K、D146K由于第、位点loop区的第一个氨基酸被分别突变为K，而导致分别丧失了第、位点的金属离子结合能力，说明EF-手loop区的第一个天冬氨酸残基在与金属离子结合中至关重要；片段分子P23和P123仍保持原金属离子结合部位的结合能力。中心蛋白的聚合行为可能是其发挥纤维收缩功能的化学基础。共振光散射技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表明中心蛋白的聚合行为依赖金属离子的结合，D37K、D73K、D146K由于丧失了部分金属结合性质，聚合程度有大小不等的减弱；聚合过程分为两个阶段，C-端结合金属离子后聚合程度小，N-端结合金属离子后聚合程度大。P23和P123片段分子的共振光散射实验表明，片断分子的聚合小于全分子的，P23由于缺乏N-端而聚合最小。说明中心蛋白的聚合是全分子的全部结合位点共同参与的过程。离子强度增大和疏水探针TNS浓度增大的都能减弱中心蛋白的聚合，说明聚合过程是静电作用和疏水作用共同起作用。此外，蛋白质浓度、酸度、温度等也对蛋白质的聚合行为有一定的影响。铽离子比钙离子更能促进聚合。TNS检测中心蛋白构象变化实验表明：中心蛋白结合金属离子后发生的构象变化使蛋白质的疏水区更加暴露；C-端结合金属后构象变化(疏水区暴露)小，N-端结合金属后构象变化(疏水区暴露)大。这个过程也明显地分为两个阶段，和聚合行为是对应的。蜂毒素是常用于钙调蛋白与靶目标作用研究的模拟靶肽。本文使用蜂毒素为靶肽研究了野生型中心蛋白、定点突变体(G115W)及截短中心蛋白分子(P23、P123)与靶目标的作用。结果显示：在pH7.4、10mMHepes条件下，中心蛋白可与蜂毒素稳定结合，形成1：1的配合物，该结合行为不依赖金属离子的结合；相同条件下P23、P123不与蜂毒素结合。即C-端结构域是中心蛋白与靶目标作用的功能区，而N-端结构域是中心蛋白聚合行为的功能区。最后研究了中心蛋白和三氟啦嗪钙调蛋白的功能阻断剂的作用。发现中心蛋白能结合4个三氟啦嗪，结合后既减弱了中心蛋白的聚合行为，也很大程度地影响中心蛋白与蜂毒素的结合，表明三氟啦嗪是中心蛋白可能的生物功能阻断剂。【关键词】：中心蛋白金属离子聚合构象变化【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：Q51【目录】：主要创新点9-10略语表10-11中文摘要11-14英文摘要14-17第一章综述17-451.1引言171.2EF-手结构蛋白的性质17-221.2.1EF-手结构蛋白的概况和分类17-181.2.2EF-手结构蛋白的钙配位性质18-201.2.3成对的EF-手结构是蛋白功能单位201.2.4调节功能和结构功能20-221.3中心蛋白的结构22-241.3.1中心蛋白的序列分析22-241.3.2中心蛋白的高级结构241.4中心蛋白的作用机制24-261.5中心蛋白的功能26-331.5.1绿藻中心蛋白26-271.5.2酵母中心蛋白27-291.5.3哺乳动物细胞中心蛋白29-311.5.4高等植物中心蛋白31-321.5.5原生生物中心蛋白32-331.6本课题研究意义和设计思路33-341.6.1研究意义331.6.2设计思路33-34参考文献34-45第二章中心蛋白突变体和截短型重组质粒的构建45-582.1引言452.2材料45-472.2.1菌种与质粒452.2.2寡核苷酸45-462.2.3主要酶及生化试剂462.2.4主要试剂46-472.2.5主要仪器设备472.3方法47-522.3.1重组质粒(pGEM-T-easy-centrin)的提取和鉴定47-482.3.2突变的重组质粒(pGEM-T-easy-M-centrin)构建48-522.3.3片段分子的基因片段522.4实验结果52-542.4.1重组质粒(pGEM-T-easy-centrin)的提取和鉴定522.4.2突变的PCR产物扩增结果、酶切和PCR鉴定52-532.4.3片段分子的PCR产物扩增结果53-542.4.4突变的重组质粒pGEM-T-easy-M-Centrin序列测定542.5讨论54-552.5.1突变的重组质粒(pGEM-T-easy-M-centrin)基因的构建542.5.2PCR实验54-55参考文献55-58第三章中心蛋白突变体和截短型的表达、纯化58-713.1引言583.2材料58-603.2.1菌种与质粒583.2.2主要酶及生化试剂58-593.2.3主要试剂59-603.2.4主要仪器设备603.3方法60-643.3.1重组表达质粒pGEX-6p-1-M-centrin(或者片段基因)的构建60-623.3.2融合蛋白的表达鉴定623.3.3目标蛋白的分离纯化62-643.4实验结果64-683.4.1突变的重组质粒pGEX-6P-1-M-Centrin酶切和PCR鉴定64-653.4.2截短型重组载体的酶切鉴定653.4.3重组菌的小量试表达65-663.4.4蛋白的纯化66-673.4.5截短型P23、P123的表达和纯化67-683.5讨论68-693.5.1突变蛋白和截短蛋白一级结构分析683.5.2重组蛋白的表达和纯化68-69参考文献69-71第四章中心蛋白的金属离子结合性质71-874.1引言714.2材料71-724.2.1主要试剂71-724.2.2仪器724.3方法72-734.3.1稀土离子(Tb(3+)储备液的配制724.3.2不同缓冲液的样品的制备724.3.3蛋白浓度测定724.3.4紫外光谱的测定724.3.5荧光光谱的测定72-734.3.6圆二色谱的测定734.4实验结果73-834.4.1中心蛋白野生型(Cen)和G115W的紫外光谱734.4.2脱钙中心蛋白野生型(Cen)和G115W与钙结合的紫外差光谱73-744.4.3脱钙中心蛋白野生型(Cen)和G115W与钙和铽结合的CD谱74-754.4.4不同离子和Cen结合的构象变化75-764.4.5Cen结合Ca(2+)和Tb(3+)后的聚合现象76-774.4.6中心蛋白野生型(Cen)和G115W的荧光光谱77-794.4.7Cen和G115W对铽离子的敏化荧光光谱79-814.4.8P123和P23对铽离子的敏化荧光光谱81-824.4.9D37K、D73K和D146K对铽离子的敏化荧光光谱82-834.5讨论83-854.5.1金属结合位点的亲和性83-844.5.2loop区第一个氨基酸D的重要性844.5.3EF-hand结构的协同性84-85参考文献85-87第五章中心蛋白的聚合性质87-995.1引言875.2材料87-885.2.1主要试剂875.2.2Nature-PAGE相关试剂87-885.2.3仪器885.3方法885.3.1稀土离子(Tb(3+)储备液的配制885.3.2TNS溶液的配制885.3.3样品的制备885.3.4蛋白浓度测定885.3.5荧光光谱的测定885.3.6Nature-PAGE凝胶电泳885.4实验结果88-965.4.1共振光散射88-895.4.2中心蛋白的聚合行为89-905.4.3蛋白浓度对聚合的影响905.4.4温度对聚合的影响90-915.4.5pH对聚合的影响915.4.6离子强度对聚合的影响91-925.4.7TNS对聚合的影响92-935.4.8片段分子P23、P123的聚合现象93-945.4.9突变体D37K、D73K和D146K的聚合行为94-955.4.10Nature-PAGE电泳检测中心蛋白聚合行为95-965.5讨论96-975.5.1聚合的性质965.5.2聚合的本质96-97参考文献97-99第六章TNS检测中心蛋白结合金属后的构象变化99-1126.1引言996.2材料996.2.1主要试剂996.2.2主要仪器996.3方法99-1006.3.1储备液的配制99-1006.3.2蛋白样品的制备1006.3.3光谱的测定1006.4实验结果100-1086.4.1中心蛋白和TNS作用的荧光光谱1006.4.2中心蛋白和TNS结合100-1046.4.3TNS和突变体G115W的色氨酸残基间的能量转移104-1066.4.4Cen-TNS与Tb(3+)结合的荧光光谱106-1076.4.5D37K-TNS、D73K-TNS与Tb(3+)的结合1076.4.6P123-TNS、P23-TNS与Tb(3+)的结合107-1086.4.7不同离子对P23构象变化的比较1086.5讨论108-1106.5.1中心蛋白结合金属离子后发生构象变化108-1096.5.2不同金属对构象变化的影响109-110参考文献110-112第七章中心蛋白和蜂毒素的作用112-1217.1引言1127.2材料1127.2.1主要试剂1127.2.2仪器1127.3方法112-1137.3.1储备液的配制1127.3.2蛋白样品的制备1127.3.3蜂毒素储备液的配制112-1137.3.4荧光光谱1137.4实验结果113-1177.4.1中心蛋白和蜂毒素的结合113-1147.4.2金属离子对中心蛋白和蜂毒素结合的影响114-1157.4.3pH对中心蛋白和蜂毒素结合的影响1157.4.4TNS对中心蛋白和蜂毒素结合的影响115-1167.4.5片段分子P23、P123与蜂毒素的作用116-1177.4.6G115W与蜂毒素的作用1177.5讨论117-1197.5.1中心蛋白和蜂毒素的结合117-1187.5.2中心蛋白和蜂毒素的作用模式118-1197.5.3中心蛋白和蜂毒素的作用力119参考文献119-121第八章中心蛋白和三氟啦嗪的作用121-1288.1引言1218.2材料121-1228.2.1主要试剂121-1228.2.2仪器1228.3方法1228.3.1储备液的配制1228.3.2蛋白样品的制备1228.3.3TFP储备液的配制1228.3.4荧光光谱1228.4实验结果122-1268.4.1TFP的光谱性质1