针刺联合胎盘间充质干细胞治疗脑瘫痪大鼠模型.doc

www.CRTER.org史华，等. 针刺联合胎盘间充质干细胞治疗脑性瘫痪大鼠模型针刺联合胎盘间充质干细胞治疗脑性瘫痪大鼠模型史 华，张 璞，郭 鑫，介小素(河南中医学院第二附属医院小儿脑病康复科，河南省郑州市 450000)引用本文：史华，张璞，郭鑫，介小素. 针刺联合胎盘间充质干细胞治疗脑性瘫痪大鼠模型J.中国组织工程研究，2016，20(19):2789-2795.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.008 ORCID: 0000-0003-3989-9810(史华)文章快速阅读：针刺与胎盘间充质干细胞移植联合治疗脑性瘫痪大鼠史华，男，1982年生，河南省郑州市人，汉族，2009年河南中医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事针灸治疗儿童神经系统疾病的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)19-02789-07稿件接受：2016-03-14http:/WWW.将胎盘间充质干细胞立体定向注射到右侧纹状体区和大脑皮质脑性瘫痪模型Wistar大鼠针刺水沟、大椎、百会、关元、承浆和气海6个穴位结局：联合治疗后体质量增加、握持牵引时间延长、足错误次数减少、觅水时间缩短、觅水错误次数减少、觅水重复次数减少，优于单纯针刺疗法和单纯细胞移植疗法 文题释义：胎盘间充质干细胞的免疫调节：胎盘间充质干细胞是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡。Morris水迷宫实验：是一种强迫实验动物(大鼠、小鼠)游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，Morris水迷宫主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马/外海马研究、智力与衰老、新药开发/筛选/评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学等领域。摘要背景：针刺和间充质干细胞移植均对脑性瘫痪有一定的治疗效果。 目的：探讨针刺联合胎盘间充质干细胞移植对脑性瘫痪模型大鼠的治疗效果。方法：将35只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组、移植组和针刺联合移植组，除对照组外，其他4组建立脑性瘫痪模型。造模后7 d移植组大鼠在右侧纹状体区和大脑皮质下移植10 L胎盘间充质干细胞(11011 L-1)；针刺组在水沟、大椎、百会、关元、承浆和气海6个穴位针刺治疗；针刺联合移植组按上述方法给予胎盘间充质干细胞移植和针刺治疗；模型组和对照组不做任何处理，干预7 d后，测量大鼠的体质量、神经功能，并观察脑组织的病理形态学变化。结果与结论：大鼠的体质量增长率：对照组针刺联合移植组针刺组及移植组模型组，针刺组和移植组大鼠的体质量增加相似，其他组间比较差异有显著性意义(P 针刺联合移植组针刺组、移植组模型组，针刺组和移植组大鼠的神经功能改善相似，其他组间比较差异有显著性意义(P combination group acupuncture and transplantation groups model group, and all groups had significant differences except the two groups of acupuncture and transplantation (P 0.05); findings from holding tract, foot error and water finding in maze tests showed the neurological function was best in the control group, followed by the combination group, as well as acupuncture and transplantation groups, and the worst in the model group. All groups had significant differences except acupuncture and transplantation groups (P 0.05). Besides, in the model group, cells in the brain and hippocampus decreased, arranging disorderly with fuzzy structure, and inflammatory cells appeared; pathological changes in the other groups were in between control group and model group, Additionally, brain tissues in the combination group exlibited better pathological changes than those in the acupuncture and transplantation groups, which were similar with the normal brain tissues. To conclude, acupuncture, placenta derived mesenchymal stem cells transplantation, or their combination can improve neurological function in rats with cerebral palsy, especially the combination treatment. Subject headings: Cerebral Palsy; Acupuncture; Placenta; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Tissue EngineeringFunding: the Nursery Project of Henan University of Chinese Medicine, No. MP2011-1Cite this article: Shi H, Zhang P, Guo X, Jie XS. Combination of acupuncture with placenta derived mesenchymal stem cell transplantation for cerebral palsy in a rat model. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(19):2789-2795.2793ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction随着医学的不断发展，新生儿抢救技术的不断提高，新生儿死亡率下降，但脑性瘫痪(简称脑瘫)的发生率不断升高。脑瘫在中医属“五软”、“五迟”和“五硬”范畴，与肝脾肾密切相关。针刺可以改善患儿神经行为功能已得到大家广泛认可。间充质干细胞具有自我更新和分化能力，能够归巢到神经损伤部位，并不断增殖，分泌细胞因子修复神经损伤，使其在脑瘫中也有不少研究。目前在脑瘫的治疗中研究最多的是骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞等，其中骨髓间充质干细胞数量、寿命和分化潜能会随年龄增长而降低，脐血间充质干细胞具有免疫原性等，均使其在临床的应用受到限制。实验建立脑瘫大鼠模型，对其进行针刺和胎盘间充质干细胞移植治疗，发现单纯针刺、单纯胎盘间充质干细胞移植和针刺联合胎盘间充质干细胞移植均能改善脑瘫大鼠的神经功能，其中针刺联合胎盘间充质干细胞移植治疗的效果最好。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2013年4月至2014年7月在河南中医学院第二附属医院实验室完成。1.3 材料1.3.1 实验动物 孕15-17 d、清洁级、健康妊娠Wistar大鼠5只，用于制备胎盘间充质干细胞；出生7 d龄、清洁级、健康雄性Wistar大鼠35只，体质量12-14 g，用于动物实验。7 d龄大鼠由母鼠在标准条件下哺乳，光照和黑暗各12 h交替环境中标准饲养。所有大鼠购自河南者实验动物中心，符合卫生部一级动物标准，得到动物伦理学委员会批准。1.3.2 主要试剂 -MEM培养基(美国Hyclone公司)；多聚甲醛(北京中山生物技术有限公司)；L-谷氨酰胺(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；胎牛血清(天津四季生物研究所)；PBS(广州赛业生物技术有限公司)；青霉素、链霉素(沈阳东药集团公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；小鼠抗大鼠CD29，CD44，CD45，CD90，CD105单克隆抗体(美国BD公司)。1.3.3 主要仪器和设备 超净工作台(苏州净化设备厂)；纯水仪(美国Millipore公司)；电子天平(德国SARTORIUS公司)；流式细胞仪(Beckman Coulter, Inc.)；倒置相差显微镜、荧光显微镜、普通光学显微镜(日本Olympus公司)；超低温冰箱(美国 Forma Scientific Inc.)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；石蜡切片机(德国SLEE公司)；手揿计数器(绍兴市医疗器械一厂)；TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；pH计(上海Mettler Toledo器械公司)；Leica EG1140石蜡包埋机、组织切片机(德国Leica公司)；BIO-RAD Model550酶联免疫检测仪(日本BIO-RAD公司)；37 恒温CO2孵箱(德国Heraeus公司)；冻存管、培养瓶、培养板(美国Corning公司)；脑室定位仪(西安西北光电仪器厂)；血球计数板(浙江玉环县求精医用仪器厂)。1.4 实验方法1.4.1 胎盘间充质干细胞分离和培养 将5只妊娠大鼠处死，取出胎盘，冲洗干净，剪成小块，放入离心管中，加入生理盐水，沉降半分钟，倒掉上清液，同样方法冲洗6次后开始细胞培养。将组织放入含有胎牛血清的培养基中，大约培养至5 d时可见组织块中有细胞游离出来，大约培养10 d时见组织块周围有大片细胞群生长，去除组织块，胰蛋白酶消化，血清终止消化，吹打后将脱落下来的细胞离心，用含胎牛血清的培养基重悬细胞，将细胞密度调整为5104/cm2，放入CO2孵箱中培养，每周进行2次换液，显微镜下观察细胞的形态变化，培养12-14 d细胞接近融合，开始传代培养。1.4.2 胎盘间充质干细胞的鉴定 选择第4代融合80%的贴壁细胞进行鉴定，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，离心，收集细胞并计数，加入荧光素标记的小鼠抗大鼠CD29、CD44、CD45、CD90和CD105的流式专用抗体孵育，PBS洗涤后离心，重悬细胞后用流式细胞仪进行鉴定。1.4.3 绿色荧光蛋白转染胎盘间充质干细胞 取生长良好的第3代细胞进行转染，转染前用完全培养液稀释病毒，将培养液和细胞沉淀混匀，培养箱中过夜培养，第2天吸去旧培养液，加入新鲜培养液，继续过夜培养，显微镜下观察发现绿色荧光，表示转染成功，转染成功后，细胞融合至90%瓶底时进行传代培养。1.4.4 动物分组 将35只大鼠随机分为5组：对照组、模型组、针刺组、移植组、针刺联合移植组，每组7只。1.4.5 建立脑瘫大鼠模型 除对照组外，其他4组大鼠经异氟烷浸润麻醉成功后，固定到手术台上，消毒皮肤，分离右侧颈总动脉，双重结扎后剪断血管，缝合皮肤，休息2 h后，放入密闭缺氧箱中，通入体积分数为92%N2和体积分数为8%O2混合气体，3 h后取出，放回母鼠旁边继续哺乳。1.4.6 动物处理 模型建立后7 d，移植组大鼠经固定在立体定向架上的微量注射器将10 L胎盘间充质干细胞(11011 L-1)移植到右侧纹状体区和大脑皮质下；针刺组经水沟、大椎、百会、关元、承浆、气海6个穴位针刺治疗，1次/d，治疗7 d；针刺联合移植组按上述方法给予移植和针刺治疗；模型组和对照组不做任何处理。1.4.7 体质量测定和行为学观察 治疗后每天测量大鼠的体质量，并观察大鼠的爬行、平衡、活动和有无惊厥情况。握持牵引实验：治疗后每天将一塑料杆水平放置在离桌面50 cm的位置，让大鼠用前爪抓住塑料杆悬挂，记录悬挂时间。足错误实验：治疗后每天在水平放置一网格，让大鼠在网格上行走，记录大鼠2 min内前后肢或者爪子掉下来的次数。迷宫觅水实验：治疗后每天在放射性迷宫中央放一直径25 cm平台，周围放置8个对称分布的臂，臂长度 55 cm，臂末端有小孔，大鼠禁水48 h后进行实验，每天觅水半小时，开始2 d在每个臂末端孔中都放水，让大鼠自由觅水，空间测试时，在3个臂末端孔中加水，每天测5次，共测试3 d，测试时将大鼠放在同一臂上，以3个臂的水都找到结束，记录找到3个臂水的时间、重复进入去过臂的次数、进入没有水的臂的次数。1.4.8 各组大鼠大脑病理学分析 移植后28 d时，多聚甲醛灌注固定心脏，取出大脑，分离脑组织，多聚甲醛固定，常规进行苏木精-伊红染色，镜下观察大鼠脑组织的病理形态学变化。1.5 主要观察指标 大鼠的体质量。大鼠的爬行、平衡、活动情况。大鼠脑组织的病理形态学变化。1.6 统计学分析 所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用s表示，多组间数据用two-way ANOVA分析，两两之间比较用Tukeys HSD检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 胎盘间充质干细胞的形态 将胎盘组织接种到培养瓶中进行原代培养，48 h见少量细胞从胎盘组织中爬出，培养第5天时出现较多的贴壁细胞，并形成细胞集落，部分出现克隆样增生，12-14 d时贴壁细胞融合达90%以上，呈漩涡状分布。传代培养后第1-3代细胞呈多样化，多为成纤维细胞，也可见到圆形或者多角形细胞，传代至第5代时，成纤维细胞为主，细胞大小一致(图1)。2.2 胎盘间充质干细胞的鉴定 流式细胞仪检测结果显示：第4代细胞CD29、CD44、CD90和CD105细胞表型呈阳性表达，CD45细胞表型呈阴性表达。2.3 实验动物数量分析 35只大鼠依从性良好，无脱落，均进入分析。2.4 各组大鼠的体质量增长情况 对照组、模型组、针刺组、移植组和针刺联合移植组大鼠体质量增长率分别为(99.618.36)%，(59.177.63)%，(76.54 14.11)%，(78.3716.15)%，(83.437.75)%。统计学分析显示，模型组大鼠的体质量比对照组大鼠明显减轻，两者比较差异有显著性意义(P 0.05)，针刺组、移植组和针刺联合移植组大鼠的体质量均较对照组轻(P 0.05)、较模型组重(P 0.05)，针刺联合移植组大鼠的体质量较针刺组和移植组增加(P 0.05)。2.5 各组大鼠握持牵引实验结果 对照组、模型组、针刺组、移植组、针刺联合移植组大鼠的握持牵引时间分别为(46.5112.04) s，(29.1312.53) s，(35.5313.51) s，(36.2517.24) s，(43.139.27) s。对照组的握持时间最长，模型组的握持时间最短，针刺组、移植组和针刺联合移植组的握持时间介于两者之间，针刺组、移植组和针刺联合移植组的握持时间与模型组和对照组比较，差异均有显著性意义(P 0.05)，针刺联合移植组的握持时间大于针刺组和移植组，差异均有显著性意义(P 0.05)。2.6 各组大鼠足错误实验结果 对照组、模型组、针刺组、移植组、针刺联合移植组大鼠的足错误次数分别为0.690.71，3.541.33，2.271.32，2.320.23，1.140.67。对照组的错误次数最少，模型组的错误次数最多，针刺组、移植组和针刺联合移植组的错误次数介于两者之间，针刺组、移植组和针刺联合移植组的错误次数与模型组和对照组比较，差异均有显著性意义 (P 0.05)，针刺组联合移植组的错误次数少于针刺组和移植组的错误次数，差异均有显著性意义(P 0.05)。2.7 各组大鼠的迷宫觅水实验结果 2.7.1 觅水时间结果 对照组、模型组、针刺组、移植组、针刺联合移植组大鼠的觅水时间分别为(30.11 8.14) s，(200.1422.73) s，(165.5733.33) s，(166.45 27.25) s，(123.3111.47) s。对照组的觅水时间最短，模型组的觅水时间最长，针刺组、移植组和针刺联合移植组的觅水时间介于两者之间，针刺组、移植组和针刺联合移植组的觅水时间与模型组和对照组比较，差异均有显著性意义(P 0.05)，针刺组联合移植组的觅水时间短于针刺组和移植组，差异均有显著性意义(P 0.05)。 AC D C B A图2 各组大鼠脑组织苏木精-伊红染色(400)Figure 2 Hematoxylin-eosin staining of rat brain tissues in each group (400)图注：图中A为对照组大鼠大脑组织和海马区脑组织的细胞着色深，形态和结构正常；B为模型组大鼠大脑组织和海马区脑组织的细胞数量减少，排列紊乱，有炎性细胞聚集；C，D，E为针刺组、移植组和针刺联合移植组大脑和海马组织病理改变介入对照组和模型组之间，其中针刺联合移植组有向正常大脑组织接近的趋势。B图1 大鼠胎盘间充质干细胞的形态(200)Figure 1 Morphology of rat placenta derived mesenchymal stem cells (200)图注：图中A为原代胎盘间充质干细胞，有较多的贴壁细胞；B为第3代胎盘间充质干细胞，多为成纤维细胞，也可见到圆形或者多角形细胞；C为传代培养第5代胎盘间充质干细胞，成纤维细胞为主，细胞大小一致。 E2.7.2 觅水错误次数结果 对照组、模型组、针刺组、移植组、针刺联合移植组大鼠的觅水错误次数分别为7.661.42，13.431.35，11.232.31，11.35 1.42)，9.521.73。对照组的觅水错误次数最少，模型组的觅水错误次数最多，针刺组、移植组和针刺联合移植组的觅水错误次数介于两者之间，针刺组、移植组和针刺联合移植组的觅水错误次数与模型组和对照组比较，差异均有显著性意义(P 0.05)，针刺联合移植组的觅水错误次数少于针刺组和移植组，差异均有显著性意义(P 0.05)。2.7.3 觅水重复次数结果 对照组、模型组、针刺组、移植组、针刺联合移植组大鼠的觅水重复次数分别为1.550.73，3.470.88，2.180.54，2.190.75，1.870.60，对照组的觅水重复次数最少，模型组的觅水重复次数最多，针刺组、移植组和针刺联合移植组的觅水重复次数介于两者之间，针刺组、移植组和针刺联合移植组的觅水重复次数与模型组和对照组比较，差异均有显著性意义(P 0.05)，针刺联合移植组的觅水重复次数少于针刺组和移植组，差异均有显著性意义(P 0.05)。2.8 各组大鼠脑组织的病理变化 各组大鼠脑组织苏木精-伊红染色结果显示：对照组大鼠大脑组织和海马区脑组织的细胞着色深，排列整齐，层次清楚，形态和结构正常，模型组大鼠的大脑组织和海马区脑组织的细胞数量减少，排列紊乱，见囊性变，有炎性细胞聚集，细胞结构模糊。针刺组、移植组和针刺联合移植组大脑和海马组织病理改变介入对照组和模型组之间，其中针刺联合移植组的病理改善较针刺组和移植组好，有向正常大脑组织接近的趋势，见图2。3 讨论 Discussion组织工程的核心内容之一是种子细胞1-3，干细胞是一种能够自我更新分化的多潜能细胞，分为胚胎干细胞与成体干细胞，胚胎干细胞因伦理问题和成瘤性限制了其在临床的应用，成体干细胞主要有骨髓、脐血等干细胞，其中骨髓间充质干细胞数量、寿命和分化潜能会随年龄增长而降低，脐血间充质干细胞具有免疫原性，羊水间充质干细胞取材困难等，均使其在临床的应用受到限制。胎盘中也含有丰富的间充质干细胞，并且可以表达胚胎干细胞的表面标记4，表明胎盘间充质干细胞可能为比较原始的干细胞，具有比成体干细胞更广泛的更新和分化能力，并且取材方便，来源丰富。胎盘间充质干细胞是从胎盘中分离的间充质干细胞5-7，脐带附着部位间充质干细胞比较丰富8。胎盘间充质干细胞具有胚胎细胞和成体细胞的特点，可能向多种细胞分化，具有不成瘤性9-11，表面除了表达CD105、CD90、CD73等间充质干细胞的标记外，还表达CD44和CD29等。胎盘间充质干细胞在体外可以分化为神经细胞、软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞等，是比较理想的成体细胞来源12。动物实验表明：胎盘间充质干细胞可以减少阿尔茨海默病小鼠神经胶质细胞向淀粉蛋白转化13，可以延缓小鼠造血功能的衰退14，体外可以分化为血管内皮细胞15，提高周围性动脉病动物的运动能力16，促进血管再生17，另外胎盘间充质干细胞在消化系统、呼吸系统和骨组织工程领域也有研究18-19。研究发现胎盘间充质干细胞在治疗2型糖尿病、缺血性心肌病、HIV感染等疾病有良好效果20-23。胎盘间充质干细胞的作用机制可能和以下几方面有关：迁移和分泌能力：胎盘间充质干细胞能归巢到炎症或者损伤部位，并在这些部位存活增殖，抑制炎症反应，修复损伤部位24-26。造血支持作用：胎盘间充质干细胞能够表达造血相关因子，可以作为脐血干细胞的体外扩增培养基质，为建立一个脐血干细胞体外扩增微环境提供了方法27。免疫调节作用：胎盘间充质干细胞的免疫调节主要指免疫抑制作用28，具有比骨髓间充质干细胞更好的抑制作用29，免疫原性低30。分化功能：胎盘间充质干细胞作为一种间充质干细胞，具有多向分化功能，可以分化为神经细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种细胞31，甚至可以分化为子宫平滑肌细胞32。由此可见，胎盘间充质干细胞的诸多特点，使其成为比较理想的新的种子细胞。针刺是脑瘫治疗中行之有效的康复方法。针刺治疗脑瘫疗效显著，操作简单，前景比较乐观，针刺可以改善脑瘫的肢体运动功能，改善睡眠质量33。治疗脑瘫的穴位及方法有多种：头穴结合督脉以及内关、合谷和三阴交的治疗效果比较好34；靳三针对传统疗法无效的病例也有较好的效果35。实验结果发现：针刺组、移植组和针刺联合移植组脑瘫大鼠的体质量增加，神经功能改善，大脑组织病理损伤减轻，针刺组和移植组的治疗效果相似，两组之间各方面指标比较，差异无显著性意义，针刺联合移植组的治疗效果最好，优于针刺组和移植组，差异有显著性意义。由此可见，针刺和胎盘间充质干细胞移植治疗均可以改善脑瘫大鼠的神经功能，其中联合治疗的效果比单一治疗效果显著。作者贡献：实验设计为史华，实验实施为史华、张璞，实验评估为郭鑫，资料收集为介小素。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethicalissues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Liu XY, Chen J, Zhou Q, et al. 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