第二章 酶工程基础q.ppt

第二章酶工程基础 第一节酶的分类和命名第二节酶的化学本质 来源和生产第三节酶催化原理第四节酶催化反应动力学 第一节酶的分类和命名 一 酶的分类 1 氧化还原酶2 转移酶3 水解酶4 裂合酶5 异构酶6 连接酶 合成酶 7 核酸酶 催化核酸 1 氧化还原酶 Oxidoreductase 包括脱氢酶 Dehydrogenase 氧化酶 Oxidase 过氧化物酶 氧合酶 细胞色素氧化酶等如乳酸 Lactate 脱氢酶催化乳酸的脱氢反应 2 转移酶 Transferase 包括酮醛基转移酶 酰基转移酶 糖苷基转移酶 含氮基转移酶等例如 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应 3 水解酶 Hydrolase 脂肪酶 糖苷酶 肽酶等 水解酶一般不需辅酶主要包括淀粉酶 蛋白酶 核酸酶及脂酶等 例如 脂肪酶 Lipase 催化的脂的水解反应 4 裂合酶 Lyase 这类酶可脱去底物上某一基团留下双键 或可相反地在双键处加入某一基团 主要包括醛缩酶 水化酶及脱氨酶等 例如 延胡索酸水合酶催化的反应 5 异构酶 Isomerase 此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化 分别进行外消旋 差向异构 顺反异构等例如 6 磷酸葡萄糖异构酶催化的反应 6 连接酶 合成酶 LigaseorSynthetase 又称为合成酶 能够催化C C C O C N以及C S键的形成反应 这类反应必须与ATP分解反应相互偶联 A B ATP H O H A B ADP Pi例如 丙酮酸羧化酶催化的反应 丙酮酸 CO2 草酰乙酸 7 核酸酶 催化核酸 Ribozyme 核酸酶是唯一的非蛋白酶 它是一类特殊的RNA 能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应 酶用于生物催化的概况 第二节酶的化学本质 来源和生产 一 酶催化功能的结构基础 酶是蛋白质 酶分子的组 酶蛋白分子的结构特征 维持酶蛋白分子构象的力 酶蛋白一级结构与空间构像的关系 酶的活性部位 酶的化学本质 酶由氨基酸组成 分子量很大酶是高分子胶体物质 两性电解质 在电场中如蛋白质一样泳动导致蛋白质变性的因素往往也能使酶变性酶能被蛋白酶水解而失活 非蛋白催化剂 或称非酶催化剂 核酶 Ribozyme 具有催化能力的RNA脱氧核酶 deoxyRibozyme 人工合成的具有催化能力的DNA 酶分子的组成 酶按组成分类 单纯酶 不需辅酶 除蛋白质不含其他成分如水解酶类的胃蛋白酶 核酸酶 脲酶等 结合酶 全酶 蛋白质 非蛋白部分 金属离子 如羧肽酶含Zn2 小分子物质 转氨酶含磷酸吡哆醛 糖蛋白 凝血酶含糖蛋白 RNA RNaseP含RNA等 广义辅酶根据其与酶蛋白结合程度 辅酶 与酶蛋白结合不牢 极易分离 在反应溶液中与酶蛋白处于可逆的解离状态如NAD NADP 辅基 与酶蛋白结合十分牢固而不易分离如细胞色素氧化酶的铁卟啉 葡萄糖氧化酶的FAD分子 辅酶的功能 辅酶参与和底物分子作用 催化底物反应 而且对酶蛋白的稳定性起保护作用 而高分子酶蛋白提供特异性催化条件 单体酶 寡聚酶和多酶复合物 1 单体酶 monomericenzyme 仅有一条具有活性部位的多肽链 全部参与水解反应 2 寡聚酶 oligomericenzyme 由几个或多个亚基组成 亚基牢固地联在一起 单个亚基没有催化活性 亚基之间以非共价键结合 3 多酶复合物 multienzymesystem 几个酶镶嵌而成的复合物 这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应 酶蛋白分子的结构特征 蛋白质功能决定于其结构 不仅与其氨基酸组成 一级结构 有关 还与其空间结构有关 具有酶活性的蛋白质都是球蛋白 在球蛋白的分子中 一条肽链往往是通过一部分 螺旋 一部分 折叠 一部分 转角和一部分无规则卷曲而形成紧密的球状构象 在球蛋白分子中 大多数非极性侧链总是埋藏在分子内部 形成疏水核 而大多数极性侧链总是暴露在分子表面上 形成一些亲水区 在球蛋白质分子表面 往往有一内陷的空穴 此空穴往往是疏水区 能够容纳一个或两个小分子配体或大分子配体的一部分 对酶分子而言 此空穴正好容纳一个或多个小分子底物或大分子底物的一部分 此即酶活性部位 有些球蛋白具有四级结构 这类球蛋白的分子中含两条或更多条肽链 他们彼此以非共价键相连 每一条肽链都有自己的二三级结构 此多肽链即为蛋白质分子的亚单位 亚基 亚基一般由一条多肽链组成 也有的有几条多肽链由二硫键相连而成 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 维持酶蛋白分子构象的力 蛋白质多肽链何以形成二级 三级结构 为什么多数蛋白质分子总是采取内含疏水核外包亲水壳的球状或椭圆状的紧密结构 这不仅涉及到侧链间相互作用 而且涉及到侧链与溶剂环境 pH 温度 离子强度 溶质等 的相互作用 疏水的相互作用 疏水键维持四级结构起着主要作用两非极性基团 疏水基团 为了避开水相而聚集在一起的作用 蛋白质分子的多肽链中 非极性氨基酸残基 Leu Ile Val Ala Phe Tyr Pro Met 的疏水侧链有一种避开水而相互粘附的趋势 藏于蛋白质分子的内部在大多数蛋白质中 非极性氨基酸残基含量往往高达30 50 为避开水相 总是千方百计聚集在一起 在分子内部形成一个疏水核多肽链盘旋折叠 形成一个紧密球状或椭圆状结构 即使如此 有时还不足以将所有疏水残基全部包藏在由一条肽链折叠形成的核心里 过剩的疏水残基只有通过亚单位聚合以实现把剩余疏水侧链包藏在亚单位之间 因此疏水键对于维持蛋白质分子四级结构起着主要作用 氢键氢键可发生在两条多肽链之间 或一条多肽链的不同部位之间 主链骨架上羰基氧原子与亚胺基氢原子生成氢键 N H O C在一条直线上 氢键键能大约为8 4186 8J mol 长度为0 279 0 012nm 这种氢键对维持蛋白质二级结构 保持蛋白质稳定性起极其重要的作用主链骨架上这一氢键对于 螺旋 折叠 转角的维持起重要作用 CONH 在蛋白质的某些侧链之间如Ser Thr Tyr的 OH与Glu Asp的COOH可生成氢键 某些侧链与主链骨架之间 如Tyr的OH与主链骨架的CO 可构成氢键 配位键不少酶蛋白含金属离子 如固氮酶金属离子与蛋白质的连接往往是配位键 当用螯合剂从蛋白质中取出金属离子时 则蛋白质分子便解离成亚单位 或者是三级结构局部遭破坏 以致活力丧失 二硫键 S S 两个Cys的 SH可产生二硫键键能很大 约 30 100 4185 8J mol 是很强的化学键在某些蛋白质中 二硫键一旦破坏 则蛋白质活力丧失 二硫键的数目多 则蛋白质分子抗拒外界因素的能力也加强 即蛋白质分子的稳定性也增强 RNase 中的二硫桥 离子键 又叫盐键或盐桥 蛋白质分子中带正电荷的基团有 N 末端的 NH3 肽链中的Lys NH3 带负电的基团有 C 末端的 COO 肽链中的Asp COO Glu COO 带正电的极性侧链与带负电的极性侧链可发生静电吸引高浓度的盐 过高或过低的pH值可破坏蛋白质构象中的离子键 这就是强酸 强碱使蛋白质变性的原因 范德华引力不带电的极性侧链之间 或不带电的极性侧链与非极性侧链之间 或非极性侧链之间可产生范德华引力 酶蛋白一级结构与空间构像的关系 一级结构决定了蛋白质的空间结构实验证据 在8mol L尿素存在下 用巯基乙醇处理天然RNase 其二硫键全部断裂 肽链松散 活性全部丧失 当用透析法除去尿素 巯基乙醇后 RNase活力全部恢复 而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同 而在随机情况下 8个HS 形成4个 S S时 应有105种不同方式 但在复原过程中 走向随机的RNase肽链却只选择了其中一种方式 即与天然构象完全相同 这说明RNase的一级结构决定了其特定的天然构象 酶的活性部位 酶是生物大分子物质 分子量都在10000以上 至少每个酶分子由100个以上氨基酸连接而成 然而 只有少数一些氨基酸残基和催化活力有关 这些特异的氨基酸残基组成了酶的活性中心 酶与其他蛋白质的不同之处在于 酶分子在一级结构基础上通过二三级折叠盘绕 形成了各自特定的具有催化功能的活性构像区域 酶分子不是以整个分子 而是在这个区域内参与和底物结合并对底物进行催化反应 活性中心 前列腺素H2合成酶 活性中心的本质 活性中心是酶分子中与催化功能直接有关并在三维结构上相互靠近的少数几个aa残基或其上的某些基团按照特定立体构象组成的活性结构区域 是与底物结合并催化反应的场所 溶菌酶的活性中心 活性中心的特点 仅为酶分子的少数几个残基由于肽链的盘绕折叠而成 是由特定空间构象维持的一个裂隙 活性中心以外的部分对活性中心形成提供结构基础 羧肽酶活性中心 活性中心包括催化部位和底物结合部位催化部位 在催化反应中直接参与电子授受关系的部位 直接参与催化 底物敏感键在此被切断或形成新键 并形成产物 底物结合部位 指与底物特异结合的有关部位 也叫特异性决定部位 实验表明 活性中心上有7种氨基酸的频率最高 分别是 Ser His Cys Tyr Asp Glu Lys同类酶活性中心一级结构的氨基酸顺序十分相似 催化各类反应的酶 其活性中心的基团常有一定的特征 如 蛋白酶 丝氨酸 组氨酸 胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 半胱氨酸 胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 脱氢酶 酪氨酸 苹果酸脱氢酶等 转移酶 脱羧酶或异构酶 氨基 转氨酶 某些激酶 氧化还原酶 Cys二硫键 活性部位和必需基团 必需基团 这些基团若经化学修饰使其改变 则酶的活性丧失 活性部位 酶分子中直接与底物结合 并和酶催化作用直接有关的部位 必需基团 活性部位 维持酶的空间结构 结合基团 催化基团 专一性 催化性质 接触残基 辅助残基 结构残基 二 酶的生产 酶的获得是酶和酶工程研究的主要内容之一 包括酶的生产与提取纯化 1 酶的来源 2 发酵生产 3 提高酶产量的方法 4 提取纯化 5 纯度与回收率 酶的来源 1 动植物原料提取 早期多为采用例如 用动物脏器 麦芽 木瓜 菠萝等提取各种酶 尿激酶 蚓激酶 凝血酶 抑肽酶 糜蛋白酶 透明质酸酶等 2 动植物细胞培养 近二十年来研究3 微生物发酵目前工业应用酶大多数来自微生物 以微生物为生产原料有许多优点 微生物种类繁多 产酶微生物多 菌株易诱变 一种微生物产好几种酶 微生物繁殖快 生产周期短 培养方便 易提取酶 特别是胞外酶 微生物易改造 可通过各种手段培育新种 酶发酵过程可电脑控制 生产可连续化 自动化 酶的发酵生产 1 酶的生产菌 先决条件 直接影响发酵的生产成本 1 对生产菌的要求 产量高 利用廉价原料 周期短 非病源菌 生产菌要稳定 不易变异退化 不易感染噬菌体 最好分泌胞外酶 以利于酶的分离 产蛋白酶活力应很低 除蛋白酶生产菌外 目前投入工业发酵生产的酶约有60 70种 它们的生产菌种十分广泛 包括细菌 放线菌 酵母菌 霉菌其中大规模工业生产的只有将近20 30种 目前工业用酶中 蛋白酶占59 糖化酶13 淀粉酶5 葡萄糖异构酶6 果胶酶3 纤维素酶1 脂肪酶3 医药与分析研究用酶占10 3 主要产酶菌大肠杆菌 应用最广泛 因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主 被改造成表达优良性状的 工程菌 也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶 门冬酰氨酸酶 青霉素酰化酶 限制性核酸内切酶等 枯草杆菌 淀粉酶 葡萄糖氧化酶 碱性磷酸酯酶等 啤酒酵母 主要产酰化酶 醇脱氢酶 丙酮酸脱羧酶 凝血激酶 尿激酶等 曲酶 黑曲酶和黄曲酶 糖化酶 蛋白酶 果胶酶 氨基酰化酶 葡萄糖氧化酶 淀粉酶 氨基酰化酶 脂肪酶等多种酶 发酵条件对产酶的影响 1 培养基2 pH值3 温度4 溶解氧5 搅拌6 泡沫7 发酵周期优良菌种的筛选 适宜条件的确定是获得高产酶的重要措施 能较大幅度提高酶产量 尽量挖掘微生物的产酶潜力 但是措施是有限的 并且是经验的 随机性大 单靠这些措施很不够 为了使酶产量有一个飞跃 要采取另外一些有效措施 提高酶产量的方法 针对性的打破生物细胞内酶蛋白的合成机制 可以从以下方面入手 条件控制遗传控制 诱变育种 基因重组 构建工程菌 添加诱导物 降低阻遏浓度 添加表面活性剂 产酶促进剂 采用添加诱导物 解除阻遏物 流加等技术 1 添加诱导物 许多工业用酶 淀粉酶 蛋白酶 纤维素酶 半乳糖苷酶等 都属诱导酶 对于诱导酶的发酵生产 添加适量诱导物可使酶产量显著提高 原理是 加入效应物与阻遏蛋白结合 阻止其与操纵基因结合 使结构基因得以表达 实际工作中 关键是选择一个恰当的诱导物 确定诱导浓度及诱导时间 诱导物一般有以下几类 难于被利用的底物 底物类似物或底物修饰物 如 IPTG 诱导物的前体 如 犬尿酸的前体Trp 也能诱导犬尿酸酶 酶的反应产物 如 纤维二糖诱导纤维素酶 没食子酸诱导单宁酶 诱导物添加的量和时间要通过实验确定 pH 温度 细胞生长温度 2 降低阻遏浓度尾产物阻遏 可去除尾产物或使其尽量少形成 如添加尾产物类似物或其抑制剂 采用营养缺陷型菌株等 分解代谢产物阻遏 A 尽量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源 B 流加 将葡萄糖逐渐加入反应器 使反应器中的葡萄糖保持在低水平 C 添加一定量的cAMP 3 添加表面活性剂促进酶分泌到胞外细胞内酶含量提高到一定程度 会被胞内蛋白酶分解 加入表面活性剂之类促进分泌剂 可使胞内酶未被分解即被释放到胞外 因为表面活性剂有助于改善细胞通透性 因而也可打破细胞内酶合成的 反馈平衡 常用 Tween 80 Tritonx 100等 表面活性剂 增加细胞通透性 处在气液界面改善了氧的传递速度 还可以保护酶的活性 增加酶产量 生产上常用非离子型表面活性剂 离子型表面活性剂对微生物有害 用于食品医药的酶在生产中用的表面活性剂须对人畜无害 阴离子型 SDS 有抑菌作用 使蛋白质变性 阳离子型 季铵盐类 使细胞膜损伤 非离子型 PEG 聚乙烯醇衍生物 植酸类 焦糖 聚醚类 吐温 Triton X 100等 4 添加产酶促进剂 植酸钙镁 可使霉菌蛋白酶或橘青霉磷酸二酯酶产量提高1 20倍 聚乙烯醇可提高糖化酶产量 聚乙烯醇 醋酸钠等可提高纤维素酶产量 产酶促进剂对不同细胞 不同酶的作用效果各不相同 无规律可循 诱变育种 人为引起基因突变 使亲株失去固有产酶机制 诱变育种是采用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群 促使突变频率大幅度提高 然后设法采用简便 快速高效的筛选方法 从中挑选出少数符合要求的突变株 1 基因突变 是遗传物质 核酸 DNA RNA 中的核苷酸顺序突然发生稳定的可遗传的变化 包括DNA链上一对或少数几对碱基发生改变 点突变 或是DNA的大段变化 损伤 染色体畸变 突变可发生在DNA顺序的不同位置上 结构基因 调节基因 操纵基因 启动基因 2 诱变目的 诱导型组成型 以使获得的突变株在没有诱导物存在条件下 酶产量也能达到诱导水平 阻遏型去阻遏型 即获得的突变株通常引起阻遏的条件下酶产量也达到无阻遏水平 酶生物合成的模式 同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型 1 延续合成型 酶的工业生产中最理想细胞开始生长就有酶产生 细胞生长进入平衡期后 酶还可以延续生成一段时间 2 同步合成型尽量提高对应的mRNA的稳定性 如降低发酵温度等 3 滞后合成型要尽量减少阻遏物 使酶的合成提前开始 4 中期合成型从提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面进行 酶的提取 分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物 植物或微生物细胞 发酵液 离心分离 过滤分离 沉淀分离 层析分离 电泳分离 萃取分离 结晶分离等 酶的纯度与回收率 催化反应的能力 表示样品中酶的浓度 u ml酶液 整个样品中的全部酶活力 即酶活力 u ml酶液 酶液总体积 ml 酶活力 总活力 回收率 比活力 提纯倍数 提纯前后比活力之比 单位质量的蛋白质所含有的酶活力 提纯前与提纯后酶的总活力之比 酶的保存 影响酶稳定性的因素温度 低温或更低温 加甘油或多元醇 pH与缓冲液 酶的稳定范围内酶蛋白浓度 浓度高较稳定氧 有些酶易氧化失活 提高酶的稳定性 加入酶的稳定剂底物 抑制剂和辅酶SH 保护剂 二巯基乙醇 GSH DTT 金属离子 Ca2 能保护淀粉酶 Mn2 能稳定溶菌酶 Cl 能稳定透明质酸酶 表面活性剂 高分子化合物 血清蛋白 多元醇 特别是甘油和蔗糖 防止微生物污染 甲苯 苯甲酸 百里醇 第三节酶催化原理 酶作为生物催化剂与一般化学催化剂的比较 A 更高的催化效率B 更高的反应专一性C 温和的反应条件D 具有调节能力E 易变性失活 一 酶的作用方式 形成酶 底物中间络合物 酶 底物络合物学说 当一个酶在起催化作用时 首先要和底物结合形成一个酶 底物复合体 然后再催化底物转化成产物 E SESE P E Scomplex substrate 中间络合物学说的验证把温度降至 50 时 反应速度大大降低 本来不稳定的中间物相对就稳定了 这时就可以进行晶体衍射分析 二 酶的高催化效率就分子比而言 酶催化反应速度比非催化反应速度高108 1020倍 比非酶催化反应高107 1013倍 以转换数表示 大部分酶为1000左右 转换数 在一定条件下 每个活性中心或每个酶分子每秒钟催化底物转变的分子数 酶的催化机理是降低活化能 酶的催化机理 A 底物形变B 邻近与定向效应C 酸碱催化D 共价催化E 微环境效应 底物形变 扭曲 张变 酶反应时 酶活性部位与底物分子结合 由于酶活性中心关键电荷基团使底物某些敏感键发生形变 扭曲 张变 使底物分子构象改变 有关反应键削弱 从而使反应物从基态激发为过渡态 从而降低了活化能 形成过渡态络合物 加速反应进行 邻近与定向效应邻近效应是指酶与底物结合形成络合物以后 使底物与底物 酶的催化基团与底物之间 结合于同一分子的活性部位上而使活性部位的底物有效浓度得以极大提高 从而反应速度大大增大的一种效应 定向效应是指反应物的反应基之间 酶的催化基团与底物的反应基之间的正确取位后产生的反应速度增大的一种效应 酸碱催化 酶分子中具有各种酸性或碱性氨基酸侧链 酸碱催化是通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物中汲取质子 以稳定过渡态 加速反应 共价催化 共价催化又称亲核或亲电子催化 催化时 酶作为亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心 迅速形成不稳定的共价络合物 降低反应活化自由能 以达到加速反应的目的 微环境效应酶在其活性部位内造成一个疏水的微环境 有利于中间络合物的生成和稳定 三 酶作用的专一性 族专一性 可作用于一类或一些结构很相似的底物 绝对专一性 只能作用于某一底物 键专一性 旋光异构专一性 几何异构专一性 酶作用专一性的假说1 锁与钥匙学说 模板学说 认为底物分子 或其一部分 象钥匙那样专一地楔入到酶的活性中心部位 图示 2 三点附着学说认为底物的效应基团只有与酶的活性中心三点匹配 才能起反应 图示 3 诱导楔合假说认为当酶分子与底物接近时 酶蛋白受底物的诱导而发生有利于底物结合的构象变化 酶与底物在此基础上互补楔合 进行反应 图示 底物 酶 酶 底物复合物 锁与钥匙关系学说 酶 底物 不匹配 互补匹配 三点附着学说 诱导楔合假说 第四节酶催化反应动力学 一 酶分析 即酶活力测定 EnzymeAssay 酶活力 是指酶催化一定化学反应的能力 其大小可用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示 单位时间底物减少或产物增加 一个酶单位 activeunit U I U 为在确定的最适反应条件下 每分钟催化1 mol 微摩尔 底物变化所需要的酶量 国际酶委员会规定 所以 酶的单位数与速度值数值上相等 一 测定原理 测酶活力就是在确定的最适反应条件下测定酶促反应速度 酶促反应速度取决于那些因素 速度方程 米氏方程 Michaelis Menten根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称为 米氏方程 关于米氏方程的讨论 1 Km S 时 v V S Km初速度与 S 成正比的一级反应 2 若Km S 时 v V零级反应3 若Km S 时 v 1 2V 酶反应速度与 S 的关系 求米氏常数的方法 将米氏方程两侧取倒数 以1 v对1 S 作图得Lineweaver Burk方程 Lineweaver Burk作图法 双倒数作图法 Km求法 1 量横截距 2 量纵截距结合斜率 如何测反应速度 根据米氏方程 V Vm s Km s K3 E0 s Km s K3 s Km s E0 关键是如何使反应速度取决于 E0 控制一定条件 固定底物浓度 则以此测得的酶反应速度可用来定义酶浓度 如何使酶促反应速度仅仅取决于酶量 当 S 100Km时 v Vm S Km S Vm 即反应初速度接近于最大速度 而Vm K3 E0 即酶活性直接正比于 E0 而与 S 无关 表明酶活性部位全部被底物占据 在测定酶活性时 一般选择此条件 v S S 或 P S0 S P S0 2 t1 2 S0 2Vm t 测定酶活力的基本要求 1 要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素 反应速度定量酶活力 2 其余一切均应最适合于酶发挥作用 表现最大能力 所以 要建立一个酶活力测定方法 要针对以下几方面做工作 底物 pH 温度 样品 四 测定 1 测产物生成速度酶活力大小可用反应速度表示 反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示 V dS dt dP dt 2 测反应的初速度 随着反应的进行 底物浓度下降和产物增加导致逆反应从无到有 逐渐变得显著起来 酸 碱 热等也在慢慢地使酶失活变性 因此 这种情况下测的反应速度只是一种表观的 各种因素影响下的综合结果 不能代表酶的真正活性 真正能代表酶催化活力的是反应初始阶段的速度 通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间 通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间 二 酶法分析 ENZYMEANALYSIS 酶法分析是一种以酶为分析工具 分析试剂 的分析法 分析的对象可以是底物 辅酶 活化剂 酶抑制剂 主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量 常用于食品 药物 体液等样品中成分含量检测 1 基本原理 动力学法 动力学法即测初速度 通过条件控制 使待测物 如底物 辅酶 浓度在酶反应中中起决定反应速度的主导作用 这时酶反应速度和待测底物浓度间将有确定的比例关系 于是根据侧得的酶反应速度借助校正曲线就可求得待测物浓度 当 S 0 01Km时v Vm S Km S Vm Km S k3 E0 Km S k S 即反应初速度与 S 呈线性比例关系 这个原理在酶法分析中被应用 v S S 或 P S0 S0 2 S P t 终点法 又称总变量法 根据被测物质的性质 选择适宜的工具酶 对该物质进行作用 反应完成后 借助物化方法 测出其总变化量 从而计算出被测物质实际含量或浓度 动力学法和终点法有反应进行程度的差别 三 酶催化反应的抑制动力学 抑制 是指抑制剂与酶结合改变了酶活性部位构象性质 从而引起酶活力下降的一种效应 酶是蛋白质 凡因酶蛋白分子构象改变而引起酶活力丧失的作用称为失活作用凡引起酶分子一级破坏而使酶活力丧失则称为水解某些物质 它们并不引起酶蛋白变性或水解 但能使酶分子上的某些必需基团位置 主要是酶活性中心上的一些基团 发生变化 因而引起酶活力下降 甚至丧失 致使酶反应速度降低 酶的抑制剂 一概念 能降低酶催化反应速度的因素 1 失活作用2 抑制作用3 去激活作用4 阻遏作用 失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构 即引起酶蛋白变性 导致部分或全部丧失活性 抑制作用是指在酶不变性的情况下 由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失 去激活作用 某些酶只有在金属离子存在下才有活性 去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失 阻遏作用指某些因素 如激素或药物等 使细胞内酶蛋白的合成减少 反应速度的降低是由于酶分子数量的减少 每分子酶的催化效力并无变化 抑制作用的类型 不可逆的抑制作用 Irreversibleinhibition 通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的基团结合 而使酶失活 不能用透析 超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性可逆的抑制作用 Reversibleinhibition 这类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的 可用透析法除去抑制剂 使酶恢复活性可逆抑制剂与游离状态的酶之间存在着一个平衡 不可逆抑制作用的分类 专一性的不可逆抑制 仅仅和活性部位的有关基团反应 如烷化硫基的碘代乙酸 用途更广 可以用来很好的了解酶有哪些必要基团 还可用来探测酶的构象非专一性的不可逆抑制 如DFP 抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应 这种区别不是绝对的 因作用条件及对象不同 某些非专一性抑制剂有时会转化 产生专一性不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制剂 1 Ks型结合型不可逆抑制剂2 Kcat型催化型不可逆抑制剂 自杀底物 可逆抑制作用的分类 竞争性抑制 Competitiveinhibition 非竞争性抑制 Noncompetitiveinhibition 反竞争性抑制 Uncompetitiveinhibition 过量底物抑制 ExcessSubstrateInhibition 竞争性抑制 Competitiveinhibitionbyactivesitebinding 抑制剂与底物竞争 从而阻止底物与酶的结合 竞争性抑制剂具有与底物相类似的结构 能与酶分子形成可逆的EI复合物 但EI不能分解成产物P 酶反应速度因此下降 可通过增加底物浓度而解除这种抑制 Competitiveinhibitionbyconformationalchange 抑制剂不是与活性中心结合 而是结合在离其较远的抑制结合位点 结合后 抑制剂使酶产生构象改变 从而导致活性中心的改变 而不能再与底物结合 同样 若底物先与酶结合 就会阻止抑制剂的结合 由于在这种抑制下 底物与抑制物结合在不同部位 就不需要它们在化学结构上有任何相似性 竞争性抑制的动力学 在竞争性抑制中 底物或抑制剂与酶的结合都是可逆的 各存在一个平衡 KI为抑制剂常数 Km为ES解离常数当底物过量时则 经推导可得如下曲线 非竟争性抑制酶可以同时与底物及抑制剂结合 两者没有竞争作用酶与底物和抑制剂结合形成ESI中间物后 不能进一步分解为产物 因此酶活性降低这与第二种竞争性抑制机制有类似之处 区别在于 此时活性中心构象的改变并没有阻止底物的结合 而是使其不能转变成产物 非竞争性抑制的动力学 在非竞争性抑制中存在如下平衡 可推导得出如下的曲线 反竞争性抑制及其动力学 酶只有在与底物结合后 才能与抑制剂结合 即ES IESI ESI P 在反竞争性抑制中存在如下平衡 过量底物抑制 ExcessSubstrateInhibition 一般情况下 酶促反应随着底物浓度的增加而加快 然而当底物过量时 就反而可能减慢反应速度其作用机制可能是 当两底物分子同时向一酶进攻时 为了使自己能更接近活性中心 它们只能各自以一端与酶结合 这样反而阻碍了它们中的任一个与酶的正确结合 选择题 1 酶有多种调节控制 体内凝血酶的作用属于 调节 A反馈调节B激素调节C共价修饰调节D限制性蛋白酶水解调节2 由于细胞内酶蛋白的合成减少 使反应速度降低的作用是 A阻遏作用B去激活作用C抑制作用D失活作用3 对于竞争性抑制剂 当有I存在时 下述叙述正确的是 AKm增大 Vm不变 Km Vm增大 BKm增大 Vm减小 Km Vm增大CKm减小 Vm不变 Km Vm减小DKm减小 Vm减小 Km Vm增大 4 测定酶活性时要测定酶促反应的初