实验三 血清清蛋白的分离及电泳鉴定.doc

实验二 血清清蛋白的分离及电泳鉴定一、实验目的1 掌握盐析法、凝胶层析、分离提纯蛋白质的原理和方法。2 掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和方法。二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。 本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。 1蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：水化膜和表面电荷。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法是以中性盐如硫酸铵(NH)SO4)等对蛋白质作用破坏蛋白质表面水化膜而使蛋白质相互聚集而析出。不同的蛋白质沉淀需要的中性盐浓度不同，在不同盐浓度下，蛋白质溶解度不同。球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而请蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，此种盐析法称分段盐析。 盐析后蛋白质沉淀经水溶后，最大特点是保持蛋白质生物学活性，因此，盐析法是研究蛋白质分子的结构和功能的最常用方法。除盐析法，有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、柱层析法和超速离心法等也是蛋白质分离的常用方法。 2水溶后的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。3蛋白质分离效果可用电泳方法检测，根据电泳图谱与未分离前蛋白质溶液和标准蛋白质比较，判断蛋白质的分离纯化的效果。电泳法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。醋酸纤维素是指纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少。血清蛋白各组分在pH8.6缓冲液的介质中所带负电荷的数量不同各组分的分子量大小不同，向正极泳动速度不同而分离开。三、实验器材和试剂1器材：10ml具塞刻度试管、离心管、小试管、5ml吸管、滴管2支、培养皿3套、醋酸纤维薄膜、点样器、电泳槽、电泳仪、1.020cm层析柱。2试剂：(1) 葡聚糖凝胶Sephadex G-25：称10g SephadexG-25，加200ml 0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。(2) 生理盐水：称取分析纯NaCl 0.89g，蒸馏水稀释至100ml。(3) 饱和硫酸铵溶液：25时称取(NH)SO4约767g,溶解至1000ml蒸馏水中，至不能完全溶解为止，即为饱和硫酸铵溶液。(4) 巴比妥缓冲液(pH 8.6)：称取巴比妥钠15.458g巴比妥2.768g，蒸馏水定容至1000m1。(5) 氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5g,加入100ml漂洗液不断振摇,直到完全溶解。(6) 漂洗液：取95乙醇450ml，冰醋酸100m1，混匀后，用蒸馏水稀释到l000ml。四、实验操作（一）盐析沉淀蛋白质： 取10 m1具塞刻度试管1支，加入血清溶液 2.5ml，缓慢加进等量饱和(NH4)2SO4溶液，充分摇匀，见有沉淀析出，静置10min，用双层滤纸过滤，弃去沉淀，取滤液。（二）凝胶层析脱盐： 取已溶胀的Sophadex G-25装柱(柱体积约150ml，注意一气呵成，无分层)，待柱中液面降至凝胶面时，取1ml滤液加样，待柱中液面再次降至凝胶面，加蒸馏水，用蒸馏水洗脱，流速为20滴/min，分管收集，每管10滴，每管流出液取出二滴用10三氯醋酸检测，有沉淀出现者即为蛋白质洗出管, 取对应沉淀最多的收集管用于电泳鉴定。继续用蒸馏水洗柱，流出液用1BaCl2检测，直至无白色沉淀出现后，洗柱完毕关闭出口。（三）醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果： (1)取醋酸纤维薄膜一片(48cm)，在薄膜无光泽面距一端1.5cm用铅笔划一线作点样位置，将薄膜浸入pH8.6巴比妥缓冲液中，待完全渗透后取出用滤纸吸干表面水分。 (2)点样：用点样器蘸蛋白质透析液印在点样线上一侧，另一侧蘸血请作对照用。 (3)电泳：将点样后薄膜条置于电泳槽中，点样端置于负极，在醋纤膜两端搭桥，连接缓冲液，平衡5 min后通电，以电压120 V，通电约45 min。 (4)染色：用镊子将电泳后薄膜取出，直接浸入盛有氨基黑10B染色液培养皿中染色5 min。(5)漂洗：将薄膜从培养皿中取出，用漂洗液漂洗，中间换