海马细胞培养.doc

细胞培养 （普通混合培养）一、 常规必备：1. 溶液1) PDL: Sigma, Cat. No.: P-0899 避光 用超纯水配制好后过滤，200ul或400ul/tube分装, -20度储存。 母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml(或PLL：Sigma, Cat. No.: P-9404)2) HBSS: 1L NaCl 8.4g KCl 0.224g HEPES 2.38g 青霉素钠 50万单位 硫酸卡那霉素 50万单位用1M NaOH将PH值调至7.1-7.2左右,再用超纯水将渗透压调至29010，过滤，-4度储存。3）Trypsin Solution 0.125% Trypsin (Gibco BRL (1:250), Cat. No.: 27250-042) 0.02% EDTA 先用尽可能少量HBSS溶解EDTA（用1M NaOH调PH偏碱，EDTA溶解）。再加适量HBSS，用1M HCl还原PH，溶解Trypsin，最后定容。过滤，0.8ml/tube分装，-20度储存。4）DMEM （Dulbeccos Modified Eagle Medium） GIBCOCat. No.: 12100-046 (Powder, 10 x 1L) 11952-092 (Liquid, 500ml) 5）FBS Gibco, Cat. No.: 16000044, 500ml 分装：4ml/tube, -20度储存 6）F12 (F-12 Nutrient Mixture) Gibco Cat. No.: 21700-075 (Powder, 10 x 1L) 11765-045 (Liquid, 500ml)7）Neurobasal Media （without L-glutamine） Gibco, Cat. No.: 21103-049, 500ml 8）B27 Gibco, Cat. No.: 17504-0449）Glutamate Gibco, Cat. No.: 25030-14910）Cytosine Arabinoside (阿糖胞甘) SIGMA, Cat. No.: C1768-100MG 用DMEM溶液溶解，过滤，1ml/tube分装，-20度储存。（母液：500uM; 工作液：5uM）2. 器械解剖镜1台大剪刀1把短角形系结镊 2把眼科剪 2把止血钳 3把二、 准备工作（按时间顺序）1. 培养前一天：高压灭菌玻片、25ml/100ml容量瓶、50ml离心管、15ml玻璃管、培养皿（直径大概70mm）、超纯水2. 培养前：准备溶液含血清培养液：80% DMEM/10 F12/10% FBS (使用前先在培养箱孵育2个小时左右)3. 培养前：处理玻片用PDL工作液包被灭菌后的玻片，室温放置2个小时以上或-4度包被过夜。然后用灭菌好的超纯水洗三次，铺在35mm一次性培养皿内，晾干后用基配（DMEM）包被，培养箱孵育。待用。4把解剖镜和解剖器械（眼科剪1把，止血钳1把和短角形系结镊2把）放到工作台内，UV照射20min左右三、 种细胞1. 取材1. 动物房领鼠：SD rat E17-182. 工作台内准备：取冰袋、解剖液30ml和Trypsin Solution 1管，用75%酒精消毒，放台内；35mm一次性培养皿3个放在冰袋上，盛上解剖液；把Trypsin Solution放进培养箱孵育；取出一个灭菌好的培养皿（直径大概70mm），用来装胚胎。3. 取胚胎：先用75%酒精消毒器械（大剪刀1把，眼科剪1把，止血钳2把）；用适量乙醚麻醉母鼠；“V”字形剪开腹部，取出胚胎，放在准备好的培养皿内；处死母鼠；清洗器械；收拾台面。 4. 工作台内取胎鼠海马：取下胎鼠脑袋（约6个），放进装有解剖液的一次性养皿内；左手用系结镊夹住两眼睛处固定脑袋；右手用系结镊划开脑颅、露出两大脑半球，镊子与脑干垂直、在嗅球前下压、往脑干处后拉、取出大脑，置于另一装有解剖液的培养皿；左手固定脑干，右手取出两大脑半球，置于另一装有解剖液的培养皿；去膜；解剖镜下取海马。2. 消化1. 取出孵育好的Trypsin Solution,把海马放进该消化液内；在培养箱内（37度）消化12-15min；收拾台面；从培养箱取出处理好的玻片，将基配吸干。2. 消化结束后，先用孵育好的含血清培养液终止酶反应，重复3-4次把酶溶液洗干净；将海马转移到灭菌好的15ml玻璃离心管内，加10ml左右培养液，用移液管或1ml移液枪轻轻吹打至悬液中无组织块；静置3-5min；去除部分上清液，将细胞悬液转移到原来装培养液的瓶子内稀释（注意：管底要剩余部分悬液，以防内含大块组织。）3. 培养混匀最后稀释好的细胞悬液，种到吸干基配后的玻片上；标记好后尽快放进培养箱；