HIV感染的实验诊断.ppt

HIV感染的实验诊断 白立石北京市疾病预防控制中心艾滋病确认中心2008年5月 一 HIV感染后的免疫和病毒学 HIV的基因组结构和蛋白 基质衣壳核衣壳表面糖蛋白跨膜糖蛋白 蛋白酶反转录酶整合酶 HIV结构基因 有3个env 核苷酸5781 8360 编码包膜蛋白p160 120 41等 gag 核苷酸310 1860 编码病毒核心 衣壳蛋白p55 24 15 17 pol 核苷酸1629 4673 编码逆转录酶 RT p66 51 32 11等 HIV调节基因 有6个tat 上调mRNA 促病毒复制 启动rev 调节病毒mRNA 开关vif 增强出芽 释放新病毒颗粒 感染因子nef 下调mRNA 抑病毒复制 制动vpu 仅见于HIV 1 功能不详 vpx 仅见于HIV 2 功能不详 5days Imagefrom KahnandWalker M D NEJM1998 Volume339 33 39July2 感染HIV后的血清学变化 HIVRNA 浓度 p24Ag P24Ag Anti gp41 120 160 Anti p24 55 感染 1周2周6周12周8 10年 急性期 潜伏期 艾滋病期 检出线 HIV 1早期感染病毒标志物的动态观察 窗口期 血浆RNA P24 前病毒DNA HIV抗体 ELISA HIV抗体 WB HIV感染者的三种临床转归 Virus CD4 CD8aHIV CD4 CD4 CD8 CD8aHIV Virus Virus 典型8 10y 快速 4 5y 2 缓慢 长期不进展 10y 2 二 HIV酶联筛查检测方法和试剂 感染急性期 窗口期 检测试剂以ELISA为主 还有PA 斑点免疫胶体金和免疫层析 ELISA试剂为HIV1 2型 包括M和O组 N组不包括但很少 三四五代酶联试剂的差异和使用策略 三代成熟质量稳定 窗口期20d 四代提前4 9d 质量不稳定 用于血站急性感染的检测 筛查试验和确认试验的差异 酶联试验敏感性高于确认试验 四代试剂敏感性更高 确认阴性的不一定是真阴性 一 HIV抗体ELISA检测试剂 血液 第三代 双抗原夹心法 可检测所有类型抗体 由于能检出IgM抗体 缩短了窗口期 有报道说较第二代产品平均可提前5天作出诊断 第四代 双抗原 抗体 夹心法 将HIVP24抗体和HIV抗原同时包被 再加入待检血清 最后加入酶标记的HIV抗原和HIVP24单克隆抗体 同时检测血清中的HIVP24抗原和HIV抗体 第五代 HIV抗体和P24抗原实现分别检测 真正实现早期诊断 FourthGeneration ThirdGeneration SecondGeneration IgM IgG 各种HIV检测方法平均窗口期 方法平均天数第2代EIA45第3代EIA22P24抗原16HIVRNA11 二 检测试剂的质量指标灵敏度诊断试验的灵敏度有两个不同意义 1 代表一个试验能检测最少量被分析物 如抗体 的能力 通常可对阳性血清进行稀释以确认哪个试验更敏感 2 指某试验检出阳性的能力 无假阴性 一个试验有可能检出很少量的某抗体 但也可因试验中缺少适当的抗原而漏掉一些阳性样品 2 特异性指某试验正确鉴定所有阴性的能力 无假阳性 大部分HIV筛查试验不是100 特异 可用公式计算真阴性特异度 100 真阴性 假阳性注 公式中真阴性指试验中所能检测的真阴性数 如100份血清 5份真阳性 95份真阴性 与参考试验比较 某试验检出6份阳性 一份假阳性 则特异性 94 94 1 100 98 9 3 试验效率指某试验正确鉴定所有阳性和阴性的总体能力 无假阳性或假阴性 是灵敏度和特异性的综合指标 反映了该试验的总的效率 真阳性 真阴性试验效率 100 真阳性 假阳性 真阴性 假阴性注 公式中真阳性和真阴性指试验数目 在以上例子中 检测100份血清 5份真阳性 95份真阴性 1份假阳性 1份假阴性 因此4 94试验效率 100 98 4 1 94 1 4 预测值预测值与以上的参数不同 它描述的是考虑了被检人群中感染的流行因素后的试验评价 阳性预测值 PPV 定义为在所有阳性结果人群中感染个体所占比例 阴性预测值 NPV 定义为在所有阴性结果人群中未感染个体所占比例 真阳性阳性预测值 100 真阳性 假阳性真阴性阴性预测值 100 真阴性 假阴性注 公式中真阳性和真阴性指试验数目 在感染流行率较高 5 的人群中1000人受检 50份真阳性 已感染 950份真阴性 未感染 5份假阳性 试验结果 5份假阴性 试验结果 计算PPV 45 45 5 100 90 NPV 945 945 5 100 99 5 在另一人群有相同的结果 即相同数量的假阳性和假阴性 在感染流行率较低的人群 0 7 中1000人受检 7份真阳性 已感染 993份真阴性 未感染 5份假阳性 试验结果 5份假阴性 试验结果 计算PPV 2 2 5 28 6 NPV 988 988 5 99 5 5 艾滋病病原诊断中的几个问题 明确不同实验方法的意义和适应范围 HIV血清学检测方法可分初筛和确证两类 HIV初筛试验特异性不够强 有时会造成一些假阳性结果 故在初筛试验出现阳性结果时 应再重复试验 若仍为阳性再用确证试验 WestBlot 去证实 但一些非感染者的血液也会对某些抗原显示反应 出现的条带不够判为阳性的标准 在正常的非感染者人群中发生比例 15 所以如果用WB来测ELISA阴性者的血清 有些标本被视为不确定 出现不确定结果时 可能是HIV早期感染或是非特异反应 应在1 6个月后复查 并结合个体的临床表现 感染因素 WB带型等综合分析后做出结论 针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段 HIV感染后两周内 无法查到抗体 两周后出现病毒血症 可用P24抗原检测方法或测逆转录酶活性 6 8周后抗体产生时 进行抗体检测 诊断HIV感染在早期可检测抗原 而在感染后的大多数时间 可用血清学方法诊断 HIV抗体测定的预测值 试剂的敏感性和特异性可衡量优劣 但不能完全决定一个测定结果正确与否的可能性大小 与预测值关系更大 預測值除与试剂好坏有关外 还取决于测定对象本身患病率的高低 由表1可以看出 在用ELISA法对高危人群检测时 其阳性预测值为99 98 而在非高危人群中 阳性预测值仅为18 94 即查出阳性结果是真阳性的机率只有18 94 反之阴性结果的机率为99 997 表1ELISA法HIV1抗体测定的预示值 HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率 ELISA法可根据光密度 OD 值的强度直接确定 反应越强的血清 含有HIV抗体的可能性就越大 表2中正常献血员 感染率30 10万 中等强度反应时 HIV抗体阳性概率仅为1 高强度反应时 则为86 1 见表2 不仅要看阴阳结果 还要看反应强度或S CO比值 表2HIV感染机率与ELISA反应强度的关系 注 1 数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率2 低度为S CO6 三 确认试验 WB为主 还有 线性免疫试验 LIA 放射免疫沉淀试验 RIPA 和免疫荧光试验 IFA WB存有培养病毒的宿主细胞成分 容易出现非特异性反应造成不确定结果 LIA使用重组蛋白 多肽 非特异性大大减少 试剂盒有INNO LIA Pepti Lav等 IFA很少使用 一 HIV抗体强度与抗体带型的关系 二 HIV病毒载量与抗体带型的关系 三 造成WB假阳性或不确定的原因 1 实验室操作中 阴性样本被污染或洗涤不彻底 2 HIV感染急性期 窗口期附近 仅显示gp160或120 或P24 P31 P55带 此时ELISA往往已显示阳性反应3 晚期AIDS病人 部分抗体如P24 P31丢失4 其他病毒感染的交叉反应 如风疹 麻疹 腮腺炎等5 自身免疫病 高丙种球蛋白血症 全身性红斑狼疮 6 肾衰竭和血透析7 遗传性胰腺囊肿8 多次怀孕或输血9 肝病10 乙肝 狂犬等疫苗注射 使用胸腺肽 11 线粒体核酸和T细胞白细胞抗原引起的抗体 在无高危行为的献血和孕妇人群中 WB不确定率10 15 甚至高达32 Gag蛋白抗体条带最常见 ELISA筛查阳性结果中 WB不确定占4 20 俄罗斯报告占12 7 我国 125份确认为HIV 1抗体阳性 条带出现百分率为 gp160 p24为100 gp120 gp41 p66 p51和p31在96 以上 p17 p55分别为86 4 和85 6 上海 36例WB试验gp120和p24双阳性者的跟踪随访和核酸辅助诊断发现 至少24例可判定为HIV 1感染 5例样本的核酸测定结果与血清学随访检测结果的符合率达到100 25例随访到的对象中 18例样本平均17天后条带有明显进展 可以判定为HIV抗体阳转 四 WB不确定结果的有关数据 五 假阴性结果 指EIA WB的假阴性原因急性感染后的抗体迟反应不同HIV毒株型发病晚期抗体消失窗口期 几周到6个月 与当地HIV流行率有关HIV亚型 M N O组间差异 六 确认试验不确定标本的常规处理 按照 全国艾滋病检测技术规范 2004年版 的要求 只能作 3个月后复检 的处理 三个月后复检1次 连续2次 共6个月 其转归有两种可能 仍呈现不确定或阴性 则诊断为HIV抗体阴性 带型发生进展 符合HIV抗体阳性判断标准 则诊断为HIV抗体阳性 后者是真正的窗口期感染者 一般为2 3个月 最长6个月 只占很小的比例 大多数为非感染者 但由于WB反应的敏感性而出现条带 如有必要 可用辅助诊断方法对不确定样本进行实验诊断 确认结果不确定标本的辅助诊断 1 病毒载量 RT PCR NASBA b DNA 高拷贝的结果提示感染 小于18个月婴儿在10000拷贝 毫升应做HIV感染处理 注意不同方法间结果的差异 阴性不排除感染 2 免疫标志物 CD4 CD8 CTL 微球蛋白和Neopterin等 CD4计数常用 CD4 CD8小于1提示感染 3 核酸定性 DNA PCR或RT PCR 阳性不能单独用于感染的诊断 阴性不排除感染 4 P24抗原检测 阳性结果需经中和实验确认 才提示HIV感染 阴性不排除感染 因敏感性低 30 80 5 病毒分离 特异性好 但敏感性不高 潜伏期难分离6 流行病学调查和临床症状 近期是否有HIV高危行为 是否有急性期的相关症状 四 HIV感染的早期 窗口期 诊断 1 早期诊断的意义通常窗口期急性感染时出现病毒血症 此期间病毒载量 P24抗原均很高 是HIV快速复制阶段 具有高感染力 以下情况下 非常有必要尽快开展HIV感染早期诊断 1 安全用血 窗口期血液筛查 2 个体需求 暴露后诊断 包括通过输血 静脉吸毒